论文部分内容阅读
瘤胃酸中毒是反刍动物因采食大量高淀粉日粮而诱发的一种营养代谢病,研究者一直致力于探讨瘤胃酸中毒发病机制和有效的防控措施。本研究通过在高淀粉日粮中添加硫胺素,并对萨能奶山羊瘤胃发酵、微生物区系、瘤胃组织结构、瘤胃上皮炎症反应以及血液指标进行分析,以探究硫胺素缓解奶山羊亚急性瘤胃酸中毒的代谢机制。试验1 高淀粉日粮中添加硫胺素对萨能奶山羊瘤胃发酵及微生物区系的影响试验选取18只单栏饲养(1.3 × 1.3 m),处于泌乳中期平均体重:36.5±1.99 Kg,产奶量:0.71±0.03Kg/d,泌乳天数:148±3d,的萨能奶山羊,随机分为对照组(CON)、高淀粉组(HC)以及高淀粉加硫胺素组(THC,硫胺素含量200mg/Kg DMI),每组6只,试验为期8周。于早上7:00和晚上18:00各饲喂一次,期间自由饮水。试验第8周最后一天,于晨饲后4小时全部屠宰,取瘤胃液,经四层纱布过滤后,一份放在-20℃用于瘤胃发酵指标测定,另一份放在-80℃用于微生物区系测定。试验结果显示:与对照组和THC组相比,HC组的干物质采食量(DMI)、产奶量、乳脂肪含量、蛋白质含量、乳脂率、乳蛋白以及乳糖产量均显著降低(P<0.05),THC组与对照组无显著差异(P>0.05)。与HC组相比,THC组的pH值和乙酸比例显著升高(P<0.05),而丙酸比例、丁酸比例、戊酸比例、异戊酸比例、总挥发性脂肪酸(TVFA)、乳酸、丙酮酸以及LPS指标显著降低(P<0.05)。与对照组和HC组相比,THC组瘤胃液中NH3-N、硫胺素、丙酮酸脱氢酶(PDH)浓度显著升高(P<0.05)。微生物区系方面,与HC组相比,THC组的α多样性指标中ACE、Chao1、Shannon指数显著提高(P<0.05);β多样性中,主坐标(PCoA)、主成分(PCA)结果显示,THC组与对照组相似;瘤胃微生物的门水平中,与HC组相比,THC组的拟杆菌门(Bacteroidetes)显著升高(P<0.05),变形菌门(Proteobacteria)、广古菌门(Euryarchaeota)显著降低(P<0.05);同时对属水平进行分析发现,与对照组相比,HC组未注释-韦荣氏球菌属(unidentified_Veillonellaceae)、琥珀酸单胞菌属(Succinimonas)及琥珀酸弧菌属(Succinivibrio)显著提高(P<0.05);而与HC组相比,THC组的这些菌属水平显著降低(P<0.05)。结果表明:添加硫胺素在一定程度上改善了高淀粉日粮所引起的瘤胃发酵指标,避免了瘤胃微生物区系的紊乱,从而维持了瘤胃内环境的相对稳定。试验2 高淀粉日粮中添加硫胺素对萨能奶山羊瘤胃上皮形态结构及紧密连接的影响在试验1中的山羊屠宰后,取瘤胃腹囊多块,进行HE染色、电镜、TUNEL凋亡、紧密连接蛋白的基因和蛋白相对表达量的测定,试验结果显示:与对照组相比,HC组的瘤胃乳头颜色明显发黑,形态参差不齐;而THC组相较于HC组其瘤胃乳头颜色明显改善,乳头较为平滑与整齐。与对照组相比,HC组和THC组的总上皮厚度、角质层厚度、颗粒层厚度均显著降低(P<0.05),但THC组较HC组的上皮厚度明显增加(P<0.05)。HC组较对照组的TUNEL凋亡指数显著升高(P<0.05);THC组与对照组相比差异不显著(P>0.05),但与HC组相比,THC组的TUNEL凋亡指数显著降低(P<0.05)。与对照组相比,HC 组的 ZO-1、Claudin-1、Claudin-4、Occludin 的免疫组化阳性率显著降低(P<0.05),THC组ZO-1、Occludin的免疫组化阳性率与对照组差异不显著(P>0.05),而THC组中除Claudin-1以外均比HC组显著升高(P<0.05)。免疫组化阳性显色平均光密度(MOD)的结果显示,与对照组相比,HC组ZO-1、Claudin-1、Claudin-4、Occludin的平均光密度显著降低(P<0.05),THC组Claudin-1的平均光密度与CON组差异不显著(P>0.05),但与HC组相比,THC组中除了 ZO-1平均光密度外,均显著升高(P<0.05)。与对照组相比,HC组ZO-1、Claudin-1、Claudin-4、Occludin的基因表达量显著降低(P<0.05);THC组ZO-1的基因表达量与对照组差异不显著,且与HC组相比,Claudin-4的基因表达量没有显著升高(P>0.05),但ZO-1、Cladin-1和Occludin的基因表达量显著增加(P<0.05)。与基因表达相似,HC组ZO-1、Claudin-1、Claudin-4、Occludin的蛋白表达量较对照组显著降低(P<0.05);THC组ZO-1的蛋白表达量与对照组差异不显著(P>0.05),且较HC组而言,THC组的Claudin-4的蛋白表达量并没有显著升高(P>0.05),但ZO-1、Claudin-1和Occludin的蛋白表达量显著增加(P<0.05)。结果表明:高淀粉日粮对瘤胃上皮组织结构产生破坏促进瘤胃上皮细胞的凋亡,添加硫胺素可以缓解瘤胃上皮的损伤程度,促进紧密连接蛋白正常表达。试验3 高淀粉日粮中添加硫胺素对萨能奶山羊血液指标及炎症反应的影响将上述试验中获得的试验山羊瘤胃上皮,放置于-80℃冰箱保存备用,同时屠宰前从山羊的颈静脉处采集血样,在4℃下3000 × g离心15 min,然后将血浆保存在-20℃进行后续分析。试验结果显示:对照组血液中硫胺素、PDH和α-KGDHC含量显著高于HC和THC组(P<0.05),THC组较HC组显著升高(P<0.05)。对照组血液中游离LPS、乳酸、丙酮酸和乳酸脱氢酶显著低于HC和THC组(P<0.05),且THC组显著低于HC组(P<0.05)。对照组血液中Ig A、CD4+/CD8+比值、中性粒细胞百分率、淋巴细胞百分率和单核细胞百分率均显著高于HC和THC组(P<0.05),且THC组显著高于HC组(P<0.05)。对照组血浆IL-1β和CD8+百分率显著低于HC和THC组(P<0.05),且THC组显著低于HC组(P<0.05)。对照组瘤胃上皮MPO、MMP-2和MMP-9的活性显著低于HC和THC组(P<0.05),同时THC组也显著低于HC组(P<0.05)。对照组瘤胃上皮中NF-κB、IL-6、IL-8、TNF-α、TLR-4、CD68、IL-10、IL-1β、MMP-2 和 MMP-9的mRNA相对表达水平显著低于HC和THC组(P<0.05),且HC组相比,THC组的这些mRNA相对表达水平也显著降低。与基因表达相似,对照组瘤胃上皮中IL-6、TNF-α、IL-1β、p65和p-p65的蛋白相对表达均显著低于HC和THC组(P<0.05),THC组蛋白相对表达较HC组也明显降低(P<0.05)。结果表明:高淀粉日粮会导致血液中炎性因子、LPS以及乳酸含量升高,并诱发机体的炎性反应,添加硫胺素可以减少这些物质在体内的蓄积,并通过调节细胞因子活力,降低高淀粉日粮引起的瘤胃上皮炎症风险,改善瘤胃上皮屏障功能。