论文部分内容阅读
鸡传染性鼻炎是由副鸡禽杆菌(Avibacterium paragallinarum, Apg)所致鸡的一种重要的细菌性疾病。副鸡禽杆菌有A、B、C三种血清型,其有效保护性抗原成分至今尚不明了。本文利用原核表达系统成功表达了副鸡禽杆菌三个血清型菌株的血凝素蛋白,并分析了重组血凝素蛋白的免疫原性;应用噬菌体肽库技术筛选和鉴定出副鸡禽杆菌的2个免疫优势模拟抗原表位,分析了模拟抗原表位的免疫原性,研究结果为进一步研制与开发鸡传染性鼻炎新型疫苗奠定了基础。根据副鸡禽杆菌A、B、C三种血清型代表性菌株Hp8、Dalian和Modesto的血凝素基因序列,分别设计特异性引物,采用PCR技术扩增出副鸡禽杆菌三种血清型菌株的血凝素基因,序列测定结果表明,三种血清型的血凝素基因全长分别为1 035bp、1 038bp和1 026bp。分别将PCR扩增产物克隆到pET-32a (+)载体,构建出原核表达重组质粒pET- A、pET- B和pET- C。表达产物经Western-blotting及血凝和血凝抑制试验鉴定,结果表明,重组血凝素可以与相应的副鸡禽杆菌阳性血清特异性结合,并且都具有凝集鸡红细胞的活性。用纯化的重组血凝素作为免疫原分别免疫鸡,其血凝抑制抗体滴度均达到1:10以上;用相应菌株攻毒后,部分免疫鸡获得了保护,大部分试验鸡出现鼻炎症状,三种重组血凝素的保护率分别为3/10,2/10和2/10。由此表明,重组血凝素蛋白具有良好的免疫原性,但不能诱导足够的免疫保护。结果提示,血凝素可能不是副鸡禽杆菌的惟一保护性抗原。利用Biosun和Hopp-wood分子生物学软件分析了副鸡禽杆菌Hp8株血凝素蛋白的B细胞表位,结果发现在血凝素蛋白的第86位氨基酸和第186位氨基酸的附近区域可能是2个表位区,以其前后15个氨基酸作为线性表位序列( A1-YDDFGRAKLRQDGET ,A2-NKVGRWEKDGSRVDY)。采用基因工程技术将其分别展示到大肠杆菌GI826的鞭毛上,经抗原抗体结合试验表明,构建的重组菌不具有与副鸡禽杆菌抗体结合活性,提示选定的2个血凝素蛋白的线性抗原肽缺乏免疫活性。利用噬菌体随机12肽库,以A型副鸡禽杆菌多克隆抗体和C型副鸡禽杆菌单克隆抗体纯化IgG筛选。结果表明,用多抗筛选获得的噬菌体克隆中,50%具有核心氨基酸序列A-DP(M)L,单抗筛选获得的噬菌体克隆中,80%以上带有共有氨基酸序列Y-P-Q(A)WW。含有上述共有序列的噬菌体克隆不仅可以与抗体特异结合,并与副鸡禽杆菌抗原竞争结合抗体。将编码YGLLAVDPLFKP和YSPHQWWLSGAV的DNA片段分别插入质粒pFliTrx,转化大肠杆菌GI826并在鞭毛上成功展示,构建的重组菌能与相应抗体特异结合。用2个重组菌免疫鸡产生的相应抗体分别能与A型副鸡禽杆菌0083株和C型副鸡禽杆菌Modesto株结合,攻毒试验结果表明,免疫鸡分别获得了4/8和3/8的免疫保护。结果提示,鉴定出的副鸡禽杆菌的2个免疫优势模拟表位可作为候选表位,具有研制与开发鸡传染性鼻炎新型疫苗的潜力。