背景对于大多数原因导致的不育可以经过手术或药物进行治疗,但对于无精症或少精症患者而言,无法通过常规的治疗方法痊愈。近年来,间充质干细胞（Mesenchymal stem cell,MSC）MSC由于其多能性和低免疫源性被广泛应用于再生医学,MSC可以分化为所有三个胚层的高级衍生物,例如骨骼,软骨,脂肪,肌肉等,而一些研究结果表明MSC具有分化为生殖细胞（Germ cell,GC）的潜能有望应用于不育症的治疗。基于间充质干细胞的疗法有望恢复不育患者的生育能力,除了MSCs旁分泌作用对生殖功能的改善外,MSC向生殖细胞（GC）样细胞的分化仍然是修复受损生殖系统的一种有效的方法。此外,从MSC制备到患者回输之间存在时间差,且绝大多数情况下细胞处于糖氧剥夺的微环境中,维持时间差中细胞活性是MSC治疗有效性的有力保障。研究目的1.研究骨形态发生蛋白4（bone morphogenetic protein 4,BMP4）对人源脐带间充质干细胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUC-MSC）向生殖样细胞分化的影响;2.研究低温对经血源子宫内膜干细胞（Menstrual blood-derived stem cells,MenSC）在糖氧剥夺条件下活性维持效果及潜在机制。研究方法1.通过组织切块法从脐带组织中分离出hUC-MSC,在进一步的培养扩增后,使用第三代的hUC-MSC通过流式细胞数对其非造血干细胞表面标志物CD73、CD90、CD105和造血干细胞表面标志物CD34、CD45、CD11b、CD19、HLA-DR进行鉴定,通过成骨分化和成脂分化对hUC-MSC的多向分化进行鉴定。2.使用第三代的hUC-MSC,用含12.5 ng/mL BMP4进行连续诱导培养21 d,每2 d更换一次培养基并拍照记录细胞形态变化;通过RT-PCR检测生殖细胞相关基因OCT4、Prdm1、Stella等基因的表达水平;通过免疫荧光检测其蛋白表达水平的变化。3.提取对照组hUC-MSC和BMP4处理21 d hUC-MSC的总RNA进行转录组测序筛选诱导前后差异基因及相关信号通路;随后从转录组测序结果中筛选诱导前后MSC的表面标志物基因、相关多能性基因、生殖细胞相关基因和甲基化基因的表达变化,以此分析hUC-MSC是否分化为生殖样细胞。4.使用第三代的MenSC,重悬于生理盐水中,吸入密闭注射器后于4℃、25℃和37℃分别保存6 h、12 h和24 h,使用CCK8检测细胞活性,流式细胞术检测细胞凋亡,WB检测凋亡相关蛋白的表达,明确不同温度保存不同时间时MenSC生物学活性的变化。5.使用第三代的MenSC,设置对照组、自噬抑制组和自噬增强组,分别重悬于生理盐水中,吸入密闭注射器后于4℃保存6 h和12 h;流式细胞术检测细胞凋亡,WB检测自噬相关蛋白的表达变化,明确自噬在低温维持MenSC活性的作用。结果1.从脐带中成功分离获得hUC-MSCs,第三代hUC-MSCs呈现典型的纤维样细胞结构,细胞呈梭形,流式细胞仪检测显示hUC-MSCs阳性表达MSC表面标志物,如CD73、CD90和CD105,而不表达造血干细胞标志物CD34、CD45、CD11b、CD19和HLA-DR;此外,多向分化潜能检测表明hUC-MSCs具有成脂和成骨细胞分化潜能。2.BMP4诱导第三代hUC-MSCs 21天后,与对照组相比,诱导后hUC-MSCs形态发生明显改变,呈现宽大扁平的形态,且hUC-MSCs密度降低;PCR结果显示OCT4、Prdm1、Ifitm3和Stella基因表达量显著降低,免疫荧光结果显示Prdm1蛋白表达水平降低而Prdm14表达水平升高。3.转录组测序差异表达基因662个,其中上调基因153个,下调基因509个。差异基因的GO富集分析结构显示,在生物过程中差异基因主要富集于代谢过程,在KEGG富集中差异基因主要富集于自噬信号通路、核糖体RNA和核糖体蛋白信号通路中。进一步分析表明与对照组相比,诱导后MSC的表面标志物基因表达水平、多能性转录因子、生殖细胞相关基因以及DNA甲基化基因无明显差异。4.糖氧剥夺微环境中MenSC于4℃条件下活性可以维持较长时间,且活性随保存时间延长成反比;进一步研究发现4℃保存可通过缓释自噬的发生来维持MenSC活性。结论1.MSC分化为生殖细胞样细胞的过程极其复杂,仅在BMP4的作用下无法诱导hUC-MSCs分化为生殖样细胞。2.低温可通过缓释细胞自噬的发生,从而较长时间维持MenSC活性。