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背景HuD蛋白为ELAV家族的重要成员,特异性分布于神经组织中。它通过结合神经元内特异表达的mRNA3’UTR ARE元件,稳定mRNA并提高其翻译效率,对神经元的生长、发育、分化中有重要作用。现已证实,HuD的低表达与视神经发育障碍、先天性巨结肠等疾病相关,其多克隆抗体anti-Hu抗体在副肿瘤综合征、假性肠梗阻等多种疾病的发病机制中扮演一定角色。表达并纯化HuD蛋白,对研究其生物功能以及了解anti-Hu抗体在疾病中的作用有重要意义。目的构建携带GST标签的小鼠HuD蛋白重组表达质粒,通过原核表达系统表达,并进行纯化、鉴定。方法从小鼠脑组织中提取总mRNA,使用分子克隆技术RT-PCR特异扩增HuD基因cDNA,并在5’、3’端添加酶切位点,通过对RCR产物及质粒pGEX-6P-1双酶切后连接,构建GST-HuD融合蛋白表达载体pGEX-6P-1-HuD质粒,并利用E.coli BL-21(DE3)原核表达系统表达小鼠HuD蛋白全长,亲和层析纯化后PreScissionTM蛋白酶切除GST标签,通过免疫印迹技术进行鉴定。结果获得了纯化的小鼠GST-HuD融合蛋白及小鼠HuD蛋白,经鉴定其抗原表位具有生物免疫活性。结论通过分子克隆技术重建pGEX-6P-1-HuD质粒,可表达小鼠GST-HuD融合蛋白,利用PreScissionTM蛋白酶酶切去除GST标签并进行纯化,所获得小鼠HuD具备生物免疫活性,可用于anti-Hu抗体的制备及HuD蛋白生物功能的研究。背景Anti-Hu抗体是一种神经元抗核抗体,又被称为Ⅰ型神经元抗核抗体,其存在于副肿瘤综合征患者的血液及脑脊液中,与肠道动力异常有关,被作为副肿瘤综合征的血清标记物,广泛用于临床诊断及预后评估。肠易激综合征(IBS)是功能性肠病的一种主要类型,新近报道的一项研究表明,肠易激综合征患者血清中抗肠神经元抗体的阳性率高达79%,其中相当一部分可能为anti-Hu抗体。进一步明确Anti-Hu抗体与肠易激综合征的关系对深入了解其在发病机制中的角色,探讨其成为潜在的生物学标记的价值具有重要意义。目的利用间接免疫荧光技术对IBS患者血清中抗肠神经元抗体进行检测,应用蛋白印迹以及酶联免疫吸附技术对血清anti-Hu抗体进行定性、定量检测,并探讨anti-Hu抗体与IBS发病的关系,及其在IBS诊断、治疗及预后判断方面的价值。方法收集并筛选IBS患者和健康对照血液标本,以豚鼠肠黏膜下神经丛铺片为底物,通过间接免疫荧光技术检测血清标本中抗肠神经元抗体阳性率。利用WesternBlot免疫印迹法、酶联免疫吸附法定性、定量检测血清anti-Hu抗体阳性率。应用四格表法进行统计分析血清样品anti-Hu抗体阳性率与IBS及其亚型IBS-C、IBS-D的关系。结果使用以豚鼠肠黏膜下神经丛铺片为底物的间接免疫荧光法检测血清抗肠神经元抗体,IBS组阳性率为51/81例,健康对照组为6/86例；通过免疫印迹法、ELISA法检测血清anti-Hu抗体,IBS组阳性率为7/81例,健康对照组为0/86例。四格表统计分析,Anti-Hu抗体在IBS患者人群的阳性率(7/81例)显著高于健康对照人群(0/90例(P=0.0164)。IBS-C型中阳性率(3/6例)显著高于IBS-D型(4/75例)(P(双)=0.0073,P(-)=0.0073,P(+)=0),但IBS-D与健康对照间无显著差异(P=0.0967)。结论以豚鼠黏膜下神经丛铺片为底物的间接免疫荧光法显示抗肠神经元自身抗体在IBS的发病中存在一定联系。Anti-Hu抗体作为常见的一种神经元抗核抗体,可能是导致IBS原因之一。在IBS-C亚型中anti-Hu抗体的影响可能更为明显。anti-Hu抗体是否可成为IBS的生物学标记还需要进一步研究。