目的：　　人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)感染可引起以CD4+T细胞减少为主要特征的获得性免疫缺陷综合征(acquired immunodeficiency syndrome，AIDS)。　　T细胞免疫球蛋白区和黏蛋白区(T cell immunoglobulin domain and mucin domain，Tim)基因家族包括3个成员:Tim-1、Tim-3和Tim-4。Tim-3主要表达在已分化的CD4+1型辅助性T细胞(Th1)和CD8+1型细胞毒性T细胞(CTL)，少量表达于Th17细胞。后续研究发现Tim-3在固有免疫系统的细胞，尤其是在NK细胞有较高表达。Tim-3是T细胞重要的负性调控因子，可使T细胞功能减退进而加重慢性病毒感染。在HIV感染中，Tim-3在CD8+T细胞的表达量增加，使病毒特异性CD8+T细胞的增殖和分泌细胞因子能力都降低，导致CD4+T细胞计数的降低和病毒载量的升高。Tim-3的配体——半乳凝集素-9(galectin-9，Gal-9)，是一种S型外源性凝集素，广泛表达于多种免疫细胞，通过与Tim-3的结合诱导Tim-3+T细胞的死亡。尽管表达于T细胞的Tim-3可负向调控细胞功能，但表达于固有免疫细胞的Tim-3在免疫调节方面的作用目前仍存在争议。有研究显示，表达在树突状细胞和巨噬细胞的Tim-3能够增强炎症反应。自然杀伤细胞(natrual killer cell，NK)属于淋巴细胞的一个亚群，是固有免疫应答中一类重要的效应细胞，主要通过细胞毒性作用和分泌细胞因子发挥抗病毒、抗肿瘤作用。HIV-1感染者外周血NK细胞胞内储存的穿孔素和颗粒酶A减少、活化与抑制性受体表达异常，使HIV感染者NK细胞细胞毒性下降从而影响机体对病毒的清除。目前，Tim-3对NK细胞产生何种影响还不明确，Tim-3+NK细胞的研究仅见几篇报道，且局限在健康人群和慢性乙型肝炎等少数几种疾病。在HIV感染中Tim-3及其配体Gal-9对NK细胞是否发挥作用、作用机制如何以及对疾病进展有何影响尚无明确结论，相关报道仅有2篇，有待更为系统性的深入研究。　　近年来MSM(men who have sex with men，MSM)人群中的HIV感染者已成为我国HIV新发感染主体，且此人群中HIV感染者疾病进展较快。因此，本研究拟探索MSM人群中HIV感染者Tim-3及其配体Gal-9对NK细胞细胞因子(IFN-γ)分泌和脱颗粒(CD107a)功能的影响，为明确HIV感染的致病机制提供依据。　　材料与方法：　　1、研究对象　　本研究共选取实验对象41例，其中，HIV抗体阴性的健康人13例;根据中华人民共和国国家HIV/AIDS诊断标准，选择未接受过抗逆转录病毒治疗的HIV慢性感染者28例。　　(1) HIV抗体阴性健康人(HIV-negative normal control，NC):13例入选标准:HIV抗体阴性健康人群，血常规及肝功正常、乙型肝炎表面抗原及抗丙型肝炎抗体阴性，无免疫系统疾病。　　(2) HIV慢性感染者:28例　　入选标准:均来自中国医科大学附属第一医院红丝带门诊MSM人群的HIV感染者，未接受HAART治疗，感染时间一年以上。其中按CID4-T细胞数量高低分为两实验组，其中CD4-T细胞数量大于350细胞/ul为高CD4组(CD4 high)，小于350细胞/ul为低CD4组(CD4 low)，高CD4组(CD4 high)15例，低CD4组(CD4 low)13例。　　2、CD4+T细胞绝对计数　　在绝对计数管中加入20ul CD4/CD8/CD3TriTEST试剂，再用逆向加样法加入50ul混匀的待测抗凝全血，在室温下避光染色15分钟，然后加入1×BD免洗溶血素450ul，在室温下避光溶血15分钟，再用FACSCalibur流式细胞仪中的MultiSET软件进行检测并自动分析，获得CD4+T细胞数量的绝对值。　　3、HIV病毒载量测定　　采用Roche公司The COBAS(@)AmpliPrep(@)/COBAS(@) TaqMan(@) HIV-1 Test，v2.0试剂盒在COBAS(@) TaqMan(@)系统进行全自动PCR反应体系制备及病毒载量检测。检测下限为20拷贝/ml。　　4、NK细胞Tim-3及其配体Gal-9表达的检测　　用抗CD3-FITC、CD4-PEcy7、CD16-PerCP、CD56-PEcy7、Lineage-FITC(、HLA-DR-PerCP、Tim-3-PE和Gal-9APC(或Gal9-PE)荧光抗体对冻存复苏后的外周血单个核细胞(PBMC)进行表面染色，室温避光20分钟，PBS洗涤一遍，用1％的多聚甲醛固定细胞，上机检测NK细胞Tim-3与Gal-9表达、CD4+T细胞和DC细胞Gal-9表达情况，用LSRⅡ流式细胞仪中的BD FACSDivaTM软件进行检测分析。　　5、NK细胞功能的检测　　将冻存复苏后的PBMC稀释后加入96微孔板，每孔100ul，再加入抗CD107a-APC-H7和Brefeldin-A(1)ul/ml或Monensin0.7ul/ml，同时加入刺激物IL-12+IL-15(10ng/ul和50ng/ul)或PMA/ION或K562细胞，于二氧化碳(5％)培养箱37℃培养6h。收集细胞，用抗CD3-FITC、CD16-PerCP、CD56-PEcy7和Tim-3-PE荧光抗体对细胞进行表面染色，然后破膜，荧光标记单克隆抗体IFN-γ-APC胞内染色，用1％的多聚甲醛固定细胞，上机检测胞内细胞因子(IFNγ)分泌及脱颗粒(CD107a)情况。用LSRⅡ流式细胞仪中的BD FACSDivaTM软件进行检测分析。　　6、Tim-3受体阻断实验　　将冻存复苏后的PBMC稀释后加入96微孔板，每孔100ul，再加入抗CD107a-APC-H7和Brefeldin-A1ul/ml或Monensin0.7ul/ml，同时加入刺激物IL-12+IL15(10ng/ul和50ng/ul)及anti-Tim-3，于二氧化碳(5％)培养箱37℃培养6h。收集细胞，用抗CD3-FITC、CD16-PerCP、CD56-PEcy7和Tim-3-PE荧光抗体对细胞进行表面染色，然后破膜，荧光标记单克隆抗体IFN-γ-APC胞内染色，用1％的多聚甲醛固定细胞，上机检测胞内细胞因子(IFN-γ)分泌及脱颗粒(CD107a)情况。用LSRⅡ流式细胞仪中的BD FACSDivaTM软件进行检测分析。　　7、统计学分析　　应用SPSS17.0软件包进行统计分析，所有数据以中位数表示，两组间实验指标的比较采用Mann-Whitney U检验，相关性分析采用Spearman秩相关检验，P＜0.05为有统计学意义。　　实验结果：　　一、HIV感染后Tim-3受体在NK细胞的表达减少　　HIV组总NK细胞(Total NKcell)、CD56dimNK及CD56-CD16+NK细胞的Tim-3百分数低于NC组(p=0.0224，p=0.0369，p=0.0104)，其中CD4低组Tim-3+TotalNK细胞、Tim-3+CD56dimNK细胞、Tim-3+CD56-CD16+ NK细胞及CD4高组Tim-3-CD56-CD16+NK细胞百分比低于NC组(p=0.0159，p=0.0483，p=0.0455，p=0.0166)。HIV组、CD4高组和CD4低组CD56-CD16+NK细胞的Tim-3平均荧光强度均低于NC组(p=0.0179，p=0.0404，p=0.0427)。　　二、HIV感染后NK细胞分泌IFN-γ的功能降低　　总NK细胞分泌的IFN-γ百分数中，NC组均高于HIV组、CD4高组和CD4低组(p＜0.0001, p=0.0007, p=0.0003), Tim-3+NK细胞(p＜0.0001, p=0.0007, p=0.0006)和Tim-3-NK细胞(p＜0.0001，p=0.0027，p＜0.0001)分泌IFN-γ百分数也均呈此趋势。　　三、阻断Tim-3受体对NK细胞分泌IFN-γ的影响无明显变化　　使用anti-Tim-3单克隆抗体对正常人NK细胞Tim-3受体进行体外阻断实验，结果发现阻断NK细胞Tim-3之后，细胞分泌IFN-γ的百分数并无明显变化。　　四、HIV感染后Gal-9在CD4+T细胞的表达增加　　HIV组、CD4高组和CD4低组Gal-9-CD4+T细胞百分数均高于NC组(p＜0.0001，p=0.0011，p＜0.0001)，且CD4低组高于CD4高组(p=0.0106)。HIV感染者DC细胞Gal-9平均荧光强度也升高，且CD4低组高于NC组(p=0.0312)。　　五、HIV感染者CD4+T细胞Gal-9表达与疾病严重程度有关　　Gal-9+CD4+T细胞百分数与CD4+T细胞绝对数呈负相关(p=0.0343)，与病毒载量呈正相关(p=0.0484)，Gal-9在CD4+T细胞的平均荧光强度与病毒载量(LgVL)呈正相关(p=0.0364)。所以我们认为CD4+T细胞Gal-9表达与疾病严重程度有关。　　六、HIV感染者CD4+T细胞Gal-9表达与NK细胞分泌IFN-γ功能呈负相关　　在HIV组、CD4高组和CD4低组Gal-9+CD4+T细胞百分数均与总NK细胞分泌的IFN-γ百分数均呈负相关(p=0.0007，p=0.0407，p=0.0019)。　　七、Tim-3-/+NK细胞功能特性研究　　1、细胞因子(IL-12+IL-15)刺激HIV感染者NK细胞功能　　Tim-3+NK细胞和Tim-3(-)NK细胞均可分泌IFN-γ，且两者分泌IFN-γ百分数无显著性差异(p=0.9542)。但是，CD107a绝大部分由Tim-3-NK细胞释放，且Tim-3-NK细胞释放CD107a百分数显著高于Tim-3+NK细胞(p＜0.0001)。因此我们认为，细胞因子(IL-12+IL-15)刺激时，Tim-3+NK细胞是一群能够分泌IFN-γ但几乎不具有脱颗粒(CD107a)功能的细胞。　　2、不同刺激物对健康人NK细胞功能的影响　　细胞因子(IL-12+IL-15)刺激后，Tim-3+NK细胞和Tim-3-NK细胞均可以分泌IFN-γ，而Tim-3+NK细胞不释放CD107a，Tim-3NK细胞可以释放CD107a。PMA刺激后，只有Tim-3NK细胞分泌IFN-γ并释放CD107a。K562细胞刺激时后，大部分IFN-γ和CD107a由Tim-3-NK细胞分泌及释放，少部分由Tim-3+NK细胞分泌及释放。采用不同浓度PMA刺激后，Tim-3+NK细胞百分比随PMA浓度增大而减少，IFN-γ+Tim-3-NK细胞百分比随PMA浓度增大而增大，而Tim-3+NK细胞几乎不分泌IFN-γ，且IFN-γ+Tim-3+NK细胞百分比随PMA浓度增大无变化。　　结论：　　1、HIV感染者总NK细胞、CD56dimNK及CD56-CD16+NK细胞的Tim-3百分数低于正常对照。　　2、HIV感染者NK细胞分泌IFN-γ能力下降，阻断Tim-3后NK细胞IFN-γ分泌无明显变化。　　3、HIV感染后Gal-9在CD4+T细胞的表达增加，且Gal-9+CD4+T细胞百分数与CD4+T细胞绝对计数和NK细胞IFN-γ分泌量呈负相关，与病毒载量呈正相关，提示CD4+T细胞表达的Gal-9与疾病严重程度及机体NK细胞免疫功能强弱有关。　　4、体外实验发现，不同刺激物对Tim-3+NK细胞及Tim-3NK细胞功能影响不同。