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手性胺或手性氨基酸含有一个活泼的氨基官能团,是重要的手性合成砌块。转氨酶合成手性胺和手性氨基酸具有立体选择性高、反应条件温和、环境污染少等特点,但该反应为可逆反应,转化率亟待提高。以异丙胺为氨基供体,其转氨后的产物丙酮在高温下易挥发,从而促使反应朝着产物生成方向进行。因此开发耐高温转氨酶具有重要意义。本文从嗜热古细菌基因组中挖掘新转氨酶,通过异源表达、蛋白分离纯化研究其酶学性质、分子改造及在催化合成L-2-氨基丁酸中的应用等方面展开研究。以嗜热球菌Termococcus kodakarensis KOD1的基因组为模板,根据基因组中注释的转氨酶基因序列(tk0186、tk0260、tk0275、tk1094和tk2268)设计引物,扩增得到了5个转氨酶基因序列,并连接至表达载体pET28a,构建了重组转氨酶表达质粒。以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主进行诱导表达,SDS-PAGE显示重组TK0275转氨酶能可溶性表达,TK0186、TK1094和TK2268主要以包涵体形式存在,重组TK0260转氨酶未表达。经过70℃热处理和Ni-NTA柱亲和层析,获得了电泳纯TK0275转氨酶。TK0275转氨酶最适pH 8.0,最适温度75℃,在60℃、70℃和80℃的半衰期分别为44.0 h、15.5 h和6.2 h,表明该转氨酶具有良好的热稳定性。TK0275转氨酶氨基供体研究表明,其最佳氨基供体为N-乙酰-L-鸟氨酸,以异丙胺为氨基供体时,其活力仅为前者的0.5%。本文为首次研究嗜热古细菌来源的ω-转氨酶。为了提高TK0275转氨酶对异丙胺的催化活力,开展了TK0275分子改造研究。以与其同源性为46%的1VEF的晶体结构为模板,通过同源建模构建了TK0275转氨酶3D结构,分析了可能影响其活力的氨基酸残基,选择活性中心附近氨基酸为突变位点,构建了定点突变库,并从中筛选到活力分别是原来的1.23、1.36倍的突变体I33L、E174A。以异丙胺和2-酮丁酸为底物,突变体I33L、E174A催化不对称合成L-2-氨基丁酸,反应12 h,转化率分别达到31.3%和36.4%,ee值均>99.9%。