近年来,脂肪间充质干细胞（Adipose-derived mesenchymal stem cells,ADSCs）因其在应用科学不同领域的治疗潜力而受到了广泛关注。其中,来源于家畜的ADSCs具有显著的多能性、可塑性、分化潜能和免疫调节特性,其水平与人ADSCs相当,利用家畜ADSCs作为给药靶点可以为确定疾病机制以及疾病模型的有效性和安全性提供参考。此外,家畜ADSCs还可以应用于体细胞核移植从而提高基因编辑动物的克隆效率和基因转染效率。随着家畜ADSCs越来越多的应用于人类医学和畜牧学领域,探究其生物学特性和分子调控机制显得尤为必要。miRNAs作为表观遗传修饰的重要组成部分,在调控ADSCs体外增殖和多向分化过程中发挥重要作用,但对其在家畜ADSCs中的分子调控机制还知之甚少。本研究以绒山羊脂肪间充质干细胞（gADSCs）作为研究对象,分析miR-204-5p过表达对gADSCs生长特性和分化潜能的影响,并通过转录组和蛋白组联合分析结合分子生物学的手段来探究miR-204-5p过表达调控gADSCs生长特性和分化潜能的分子机制,在细胞和分子水平全面了解miRNAs对gADSCs生长特性和分化潜能的调控作用。研究结果不仅对于提高ADSCs的干细胞特性从而应用于体细胞克隆具有重要价值和意义,同时也为ADSCs应用于干细胞治疗和再生医学提供了理论依据。一、miR-204-5p过表达对gADSCs生长特性和分化潜能的影响将miR-204-5p以慢病毒介导的方式转入gADSCs使其过表达后,发现细胞形态没有发生改变,但生长缓慢。通过CCK-8和Ed U增殖活性检测发现miR-204-5p过表达使gADSCs的增殖活性降低。通过细胞周期检测和细胞凋亡检测发现miR-204-5p过表达的gADSCs在体外培养72h时,G0/G1期细胞减少,但是G2/M期细胞并没有增加,反而S期的细胞有所增加。此外,miR-204-5p过表达的gADSCs在培养24h、48h和72h时凋亡细胞数目均有所降低。通过油红O染色和脂滴定量检测发现,miR-204-5p过表达的gADSCs分化后的脂肪细胞中脂滴含量较低。实时定量PCR结果显示,miR-204-5p过表达的gADSCs分化后的脂肪细胞中,PPARG、IRS1和PERILIPIN的转录水平在15d时均显著降低。通过ELISA检测发现,miR-204-5p过表达的gADSCs分化后的神经细胞分泌的NGF明显增加,并且TAU、MAP2和RBFOX3在蛋白水平高表达,ENO2、TAU和RBFOX3在m RNA水平高表达。通过检测miR-204-5p过表达的gADSCs分化后的肝脏细胞中ALB和尿素的含量以及标志基因的表达发现,ALB和尿素含量略有增加,AFP、ALB、HNF4A和KRT18在m RNA水平高表达,但在蛋白水平仅AFP和HNF4A高表达。上述结果表明,miR-204-5p过表达会抑制gADSCs的生长、增殖和凋亡,引发细胞周期阻滞,并且会抑制gADSCs向脂肪细胞分化,但会促进其向神经细胞和肝脏细胞分化。二、转录组和蛋白组联合分析miR-204-5p过表达对gADSCs生长特性和分化潜能的调控作用对未感染的（NC组）、感染慢病毒空载体的（LV＿Con组）和感染miR-204-5p up慢病毒载体的（LV＿miR组）gADSCs进行了转录组和蛋白组差异表达分析,并重点关注了LV＿Con＿vs＿LV＿miR组中的差异基因和差异蛋白。根据功能注释,在LV＿Con＿vs＿LV＿miR组中筛选到13个差异基因和10个差异蛋白与细胞增殖抑制相关。其中,JAG1是NOTCH3的配体,已经有研究表明NOTCH3对于细胞增殖抑制具有重要作用。实时定量PCR和Western blot证实JAG1和NOTCH3在LV＿miR组中的表达上调。另外,PKA途径可以使CREB1表达下调,抑制细胞增殖。实时定量PCR和Western blot结果显示,PKA在LV＿miR组中的表达上调,而其下游的CREB1表达下调。在与细胞周期相关的19个差异基因和16个差异蛋白中,通过KEGG富集分析发现,THBS1、CDKN1A和CCND1均被富集到PI3K-AKT信号通路中。实时定量PCR和Western blot结果显示,THBS1、CDKN1A和CCND1在LV＿miR组中的表达均上调,并且该通路中的两个关键因子PIK3CA和AKT1也在LV＿miR组中高表达。在与凋亡相关的3个差异基因和4个差异蛋白中,NRAS可以通过作用于ERK1/2调控抗凋亡因子BCL2的表达。通过实时定量PCR和Western blot发现NRAS、ERK1/2、p ERK1/2和BCL2在LV＿miR组中的表达均上调。在与脂肪细胞分化相关的8个差异基因和2个差异蛋白中,ADIPOQ、LEPTIN和PPARG被富集到AMPK信号通路中。通过实时定量PCR和Western blot发现ADIPOQ、LEPTIN和AMPK在LV＿miR组中表达上调,而PPARG表达下调。另外,JAG1对于脂肪细胞分化具有负调控作用,在LV＿miR组中表达上调。在与神经细胞分化相关的8个差异基因和7个差异蛋白中,再次鉴定到了NOTCH3和JAG1两个NOTCH信号通路中的关键蛋白,并已证实这两个蛋白在LV＿miR组中显著高表达。已经有研究表明NOTCH3的表达会促进神经元分化。此外,在LV＿Con＿vs＿LV＿miR组中仅发现1个与肝脏细胞分化相关的差异基因,即E2F8。实时定量PCR和Western blot结果显示,E2F8在LV＿miR组中高表达。上述结果表明miR-204-5p过表达对gADSCs增殖的抑制作用可能是通过激活JAG1/NOTCH3信号通路实现的,也有可能通过促进PKA的表达使CREB1的表达下调来发挥其抑制作用。miR-204-5p过表达还可能通过作用于PI3K-AKT信号通路中THBS1/PIK3CA/AKT1轴使CDKN1A和CCND1的表达上调,进而引发细胞周期阻滞。miR-204-5p过表达对gADSCs的抗凋亡作用可能是通过激活NRAS/ERK1/2信号通路促进BCL2的表达实现的。miR-204-5p过表达可能通过AMPK信号通路抑制PPARG的表达,进而抑制gADSCs向脂肪细胞分化,也有可能通过作用于JAG1/NOTCH3轴来抑制脂肪细胞分化过程。此外,miR-204-5p过表达对gADSCs向神经细胞分化的促进作用可能是通过作用于JAG1/NOTCH3轴实现的,并且miR-204-5p过表达还可能通过E2F8促进gADSCs向肝脏细胞分化。三、miR-204-5p过表达调控gADSCs生长特性和分化潜能的分子机制研究通过CCK8细胞增殖活性检测发现,NOTCH激活剂Valproic acid（VPA）处理gADSCs后细胞增殖活性降低,JAG1和NOTCH3的表达上调,而抑制剂LY411575会促进gADSCs的增殖。PKA激活剂8-Bromo-c AMP处理gADSCs后PKA表达上调,其下游的CREB1表达下调,细胞增殖活性降低,抑制剂H892HCl作用效果相反。细胞周期检测结果显示,PIK3CA激活剂740 Y-P处理gADSCs后会阻止细胞进入G2/M期,引发细胞周期阻滞,PIK3CA、AKT1、CDKN1A和CCND1的表达上调,而抑制剂HS-173处理gADSCs则会促进细胞进入G2/M期。通过细胞凋亡检测发现,NRAS抑制剂Lonafarnib（SCH66336）处理gADSCs会使凋亡细胞数目增加,NRAS、ERK1/2、p ERK1/2和BCL2的表达下调。AMPK激活剂AICAR会抑制gADSCs向脂肪细胞分化,并且会使AMPK表达上调,PPARG、ADIPOQ和LEPTIN表达下调,而抑制剂Dorsomorphin（Compound C）2HCl处理gADSCs具有相反的效果。进一步分析发现,NOTCH激活剂Valproic acid（VPA）处理gADSCs也会抑制其向脂肪细胞分化。此外,Valproic acid（VPA）处理gADSCs会使神经细胞标志基因ENO2、MAP2、RBFOX3和TAU的表达上调,进而促进gADSCs向神经细胞分化,而LY411575处理gADSCs后,虽然在m RNA水平仅有RBFOX3在诱导分化后表达下调,但在蛋白水平标志基因ENO2、MAP2和TAU均低表达。综上研究得出,miR-204-5p过表达通过作用于JAG1/NOTCH3信号通路和PKA/CREB1信号通路抑制gADSCs的增殖,通过作用于PI3K-AKT信号通路中THBS1/PIK3CA/AKT1/CDKN1A轴引发细胞周期阻滞,通过激活NRAS/ERK1/2信号通路促进BCL2的表达实现抗凋亡作用,通过促进ADIPOQ和LEPTIN的表达作用于AMPK信号通路抑制PPARG的表达,进而抑制gADSCs向脂肪细胞分化。miR-204-5p过表达还可以通过作用于JAG1/NOTCH3信号通路促进gADSCs向神经细胞分化,同时抑制其向脂肪细胞分化。此外,miR-204-5p过表达可能通过E2F8促进gADSCs向肝脏细胞分化。