论文部分内容阅读
研究背景与目的:造血干细胞移植是传统方法无法治愈的血液系统疾病的最佳治疗手段,但在移植的过程中,来自供体的免疫健全的淋巴细胞识别抗原,在促炎的微环境中发生免疫反应,出现皮疹、血清胆红素升高、腹泻等临床表现,称为移植物抗宿主病（GVHD）。人类白细胞抗原（HLA）相同的亲属做供体,急性移植物抗宿主病（aGVHD）的发病率在40%左右,HLA不匹配的无关供者做供体,发病率高达80%。激素是预防和治疗GVHD的标准方案,但有效率不到50%,而且,目前没有标准的二线治疗方案。严重的GVHD患者生存率极低,因此,GVHD给患者的生存带来巨大威胁,亟需新的治疗方法。间充质干细胞（MSCs）是一类起源于中胚层的成体干细胞,具有强大的自我更新和多向分化能力。临床前研究表明,MSCs在体内外具有免疫调节作用,在高水平促炎细胞因子的刺激下,MSCs抑制炎症反应,防止组织过度损伤。因此,MSCs被广泛应用于免疫紊乱相关疾病的治疗,如GVHD。大多数检验MSCs预防或治疗GVHD安全性及有效性的临床试验都取得了令人满意的效果,但也不乏失败的案例:如美国Osiris公司的Prochymal（体外扩增的人MSCs）在治疗GVHD的Ⅲ期临床试验中未达到预期疗效,导致该产品未能通过美国FDA批准上市。原因包括:（1）MSCs的免疫相容性:暴露于炎症信号时MSCs表达MHC-Ⅰ类分子的能力上调,同时具有表达MHC-Ⅱ类分子的能力;（2）MSCs质量参差不齐:来自不同个体的MSCs质量存在差异;MSCs体外扩增造成细胞衰老,导致功能下降;冻存和复苏的过程会导致MSCs活率及功能下降;（3）MSCs的异质性:不同组织来源的MSCs存在功能差异,同一组织来源的MSCs中也存在不同的功能亚群,这些亚群免疫调节能力不同;（4）免疫系统对MSCs的影响具有两面性,不同的MSCs剂量、介入时机,会导致同一疾病的不同疗效。于是,研究者寻找其他可以替代MSCs的细胞类型,如胚胎干细胞（ESCs）和诱导多能干细胞（i PSCs）,但是,伦理问题和潜在的致瘤性阻碍了ESCs和i PSCs的临床转化。本课题组前期建立了临床级人胚干细胞系（h ESCs）,将h ESCs体外分化获得了间充质样细胞,符合MSCs国际鉴定标准,将之命名为免疫和基质调节细胞（IMRCs）。全基因组测序表明,与脐带间充质干细胞（UC-MSCs）相比,IMRCs的免疫调节基因和促组织修复基因上调,促炎基因下调,对差异表达基因进行富集分析证实,IMRCs表现为减轻的炎症反应,增强的增殖能力。因此,本研究的目的是检验IMRCs在体外抑制淋巴细胞增殖的能力以及治疗GVHD的疗效,为后续应用IMRCs开展临床试验提供重要的理论基础,为细胞治疗提供新思路。实验方法:首先,根据国际细胞治疗学会提出定义MSCs的标准对IMRCs进行鉴定:观察IMRCs的形态、流式细胞术检测IMRCs的表面标志物、化学染色鉴定IMRCs的三系分化能力;其次,将IMRCs与PBMC或CD4/8+细胞共培养,检测IMRCs对PBMC或CD4/8+细胞的增殖是否具有抑制作用,IFN-γ刺激能否增强IMRCs的作用,检测MSC的免疫抑制因子IDO的阻断剂1-MT能否阻断IMRCs的抑制作用,检测CD24+IMRC和CD24-ⅠMRCs的抑制能力有无差别,检测IMRCs能否抑制T细胞活化,ELISA检测共培养体系中细胞因子的表达水平,对与PBMC共培养的IMRCs进行RNA-seq,明确转录组变化,检测不同批次的IMRCs抑制作用是否一致,检测IMRCs制剂是否具有与新鲜培养的IMRCs同样的作用;最后,构建GVHD模型,应用IMRCs治疗,观察小鼠的生存时间、体重及GVHD临床评分,研究IMRCs对供体T细胞在受体体内活化增殖的作用。结果:（1）IMRCs在标准培养条件下,呈纺锤形贴壁生长,表达CD29、CD73、CD90、CD105,不表达CD34、CD45、CD11b、CD19和HLA-DR,具有向脂肪细胞、成软骨细胞和成骨细胞分化的能力,符合间充质干细胞的定义;（2）IMRCs能抑制PBMC和CD4/8+细胞增殖,抑制T细胞活化,抑制能力呈剂量依赖性,抑制作用与IMRCs分泌的IDO有关,IFN-γ刺激IMRCs后抑制PBMC增殖的作用增强;（3）不同批次的IMRCs抑制PBMC和CD4/8+细胞增殖的能力没有明显差别;（4）IMRCs制剂同样具有抑制PBMC和CD4/8+细胞增殖的能力;（5）GFP-ⅠMRCs与PBMC共培养后转录组学改变,差异表达基因主要参与T细胞激活、细胞因子的分泌调控、细胞之间粘附的调控等生物学过程,主要富集在细胞因子受体间相互作用、趋化因子、细胞黏附分子等信号通路上;（6）IMRCs与PBMC共培养后能显著减少共培养体系中IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-5、IL-10、IL-13、MIP-1β、GM-CSF的表达,显著升高共培养体系中IL-2、IL-6、IL-12、MCP-1的表达;（7）IMRCs能够提高GVHD小鼠的生存率,减轻肺脏、肠道、肝脏和肾脏淋巴细胞的浸润;（8）IMRCs治疗GVHD并不依赖降低嵌合比、抑制T细胞活化和改变淋巴细胞及其亚群的比例。结论:临床级人胚干细胞体外分化获得的IMRCs,符合国际细胞治疗学会提出的定义间充质干细胞的标准;IMRCs能抑制PBMC和CD4/8+细胞增殖,抑制T细胞活化,抑制能力呈剂量依赖性,抑制作用与IMRCs分泌的IDO有关,IFN-γ刺激后,IMRCs抑制PBMC增殖的作用增强;IMRCs与PBMC共培养后,转录组水平发生明显改变,进而改变共培养体系中细胞因子的表达;不同批次的IMRCs质量均一;IMRCs制剂同样具有抑制PBMC和CD4/8+细胞增殖的能力;IMRCs延长GVHD小鼠的生存时间,减轻GVHD靶器官淋巴细胞浸润,但并不能降低人PBMC的嵌合、抑制人T细胞的活化和改变人T、B淋巴细胞及其亚群的比例,具体作用机制需要进一步深入研究。