目的:恶性肿瘤是威胁人类健康的重大疾病。近年来,肿瘤免疫治疗已经成为肿瘤治疗领域的研究热点。阻断PD-1/PD-L1通路可减少免疫抑制并增强抗肿瘤效果。除抗体外,核酸适配体（aptamer）也能实现对PD-1/PD-L1通路的阻断。Aptamer是一种新型的配体分子,具有良好的生物相容性且易于合成。然而,aptamer在体内应用,还需要规避肾脏的清除及核酸酶的消化。迄今为止,DNA纳米结构用于提升aptamer对PD-1/PD-L1的阻断作用,尚未见文献报道。在本研究中,我们计划研究DNA纳米结构能否增强PD-L1 aptamer的治疗效果。Holliday Junction（HJ）是一种较为常用的DNA纳米结构,可用作抗肿瘤药物的载体。HJ是由四条单链DNA（ssDNA）通过碱基互补配对原则自组装形成的十字形DNA纳米结构。我们设计将四个PD-L1 aptamer连接到HJ十字结构的四个端点,形成四价的DNA纳米结构（Apt-HJ）,以增大整个DNA纳米结构的尺度,使其高于肾脏清除阈值,从而延长PD-L1 aptamer在体内的循环时间。Apt-HJ还进行了部分硫代修饰,以提高其核酸酶抗性。本课题计划研究Apt-HJ能否增强PD-L1 aptamer的抗肿瘤疗效。方法:利用碱基互补配对原则,使四条3’端连有PD-L1 aptamer的ssDNA通过自组装方式形成一个四价的DNA纳米结构（Apt-HJ）。通过琼脂糖凝胶电泳验证Apt-HJ是否构建成功,并利用动态光散射仪（DLS）测定Apt-HJ的粒径和zeta电位。对Apt-HJ进行部分硫代修饰,利用血清消化实验检测其效果,并通过琼脂糖凝胶电泳验证其是否能够抵抗核酸酶消化。将Apt-HJ进行FAM标记,通过流式细胞术检测该DNA纳米结构是否能够与CT26结肠癌细胞结合,并计算出Apt-HJ与CT26细胞结合的显著解离常数。通过激光扫描共聚焦显微镜进一步验证Apt-HJ是否能够与CT26细胞结合。通过动物体内实验验证Apt-HJ是否能够增强抗肿瘤效果,并同时评估Apt-HJ在体内的毒副作用。结果:在本项研究中,我们设计并构建了一种新型的DNA纳米结构（Apt-HJ）,由四个PD-L1 aptamer和一个Holliday Junction组成,以增强与肿瘤靶细胞的亲和力和体内抗肿瘤功效。四条ssDNAs（其3’端为PD-L1 aptamer,5’端为HJ序列,中间通过5 nt的Poly-A连接）,通过自组装方式构成了四价的Apt-HJ。动态光散射仪测得Apt-HJ的平均粒径约为13.22nm,高于肾脏清除阈值（约10nm）,而游离PD-L1 aptamer平均粒径大小约为7.14nm,低于肾脏清除阈值;同时测得Apt-HJ的zeta电位为-11.9mV。血清消化实验显示,与未经硫代修饰的Apt-HJ相比,硫代修饰的Apt-HJ具备更佳的核酸酶抗性和血清稳定性。流式和激光扫描共聚焦显微镜成像结果显示,与单价的游离PD-L1 aptamer相比,四价的Apt-HJ对CT26结肠癌细胞显示出更高的亲和力。亲和力定量测定结果显示,Apt-HJ与CT26细胞的的显著解离常数（Kd）为145nM,而单价游离的PD-L1 aptamer与CT26细胞的的显著解离常数为283nM,进一步证明Apt-HJ与肿瘤靶细胞具有更强的亲和力。动物体内实验结果显示,与游离PD-L1 aptamer相比,Apt-HJ显著提高了在荷瘤小鼠内的抗肿瘤功效,但毒副作用并未显著增加。结论:本课题构建了由四个PD-L1 aptamer和一个Holliday Junction组成的新型DNA纳米结构（Apt-HJ）,用于增强PD-L1 aptamer与肿瘤靶细胞的亲和力并提升抗肿瘤效果。实验结果显示,四价的Apt-HJ确实对CT26结肠癌细胞具有更高的亲和力,并具有更强的体内抗肿瘤效果。该结果表明,将多个PD-L1 aptamer连接到DNA纳米结构,可能是一种增强PD-L1 aptamer免疫疗效的有效策略。