第一部分：在胆汁淤积症中胆汁酸受体FXR对肝内雌激素代谢调控机制研究胆汁是消化系统的内分泌物,主要成分有97%的水,其余3%包括胆盐,胆固醇,少量脂肪,胆红素以及卵磷脂等。胆汁对体内多种营养的吸收和利用有着重要作用,例如对脂肪的乳化,脂溶性维生素的吸收,钙的吸收,以及调节胆囊和胰腺的功能。胆汁酸作为胆汁的重要组成还有调节肠道菌群作用。胆汁淤积症是常见的肝脏代谢类疾病之一,由胆汁生成和流动性障碍引起,或者两者同时存在,因此又叫胆汁淤积综合症。胆汁淤积症主要临床表现为黄疸和皮肤瘙痒,重者可导致肝功能衰竭。根据不同的胆汁淤积病因,临床上采取不同的治疗方式,如对于肿瘤、胆道狭窄和胆结石导致的梗阻性胆汁淤积,在确诊堵塞部分之后主要通过手术介入治疗,然后再辅助一些药物如熊去氧胆酸等。出现严重的肝功能衰竭者可能需要做肝移植手术。据统计中国0.8%-12.0%的妊娠期女性伴有胆汁淤积症,临床上主要表现为皮肤瘙痒和高水平的胆汁酸即黄疸,严重时会导致婴儿死亡,分娩后症状消失但是再次怀孕或者过量口服雌激素避孕药又会复发。研究表明,妊娠期女性雌激素水平维持在非常高的水平,过多合成的雌激素堆积在肝内,导致Na+-K+-ATP酶活性下降,肝细胞膜中胆固醇含量升高,膜通透性下降,胆汁代谢与排泄出现障碍。雌激素作为类固醇激素对人体生理代谢活动是非常重要的。有研究发现,持续地给C57小鼠高剂量的雌激素引起胆汁水平升高。肝内高水平的雌激素激活雌激素受体ER,ER能够与胆汁酸受体FXR相互作用并抑制FXR的功能。但是又发现胆汁酸激活的FXR促进雌激素受体ER的活性,因为胆汁酸CDCA与雌激素E2协同刺激乳腺癌细胞的增殖。本课题主要研究胆汁酸对雌激素的调控。首先,测定了胆汁淤积症病人的血液中雌激素与总胆汁的含量。然后随访病人手术介入治疗后,发现治疗前血液中的雌激素与胆汁酸含量是呈现一种正相关性,手术后胆汁酸水平降低了,而此时雌激素也是恢复正常水平。发现雌激素与胆汁酸含量呈正相关与肝损伤无关。为了进一步研究此现象的分子机制,使用了小鼠胆管结扎模型研究胆汁酸与雌激素之间的关系。胆管结扎模型是一种急性胆管堵塞模型,是使用非常普遍的胆汁淤积模型之一。把小鼠分成两组假手术(Sham)和结扎组(BDL),为了防止胆汁淤积导致肝损伤的干扰,在小鼠胆管结扎3天后眼球采血,检测胆汁酸与雌激素的水平变化。结果发现在BDL小鼠也发现类似人体胆汁淤积症病人的现象,胆汁酸升高,雌激素也偏高,而在假手术组中两者水平差别不明显。为了进一步验证这个结论,使用另一个胆汁酸淤积模型-胆汁酸受体FXR敲除小鼠(FXR-/-)。之前研究表明FXR-/-小鼠随着周龄增加肝内胆汁淤积加重。通过对比8周大的FXR-/-与WT小鼠(排除生理周期和性别对雌激素水平的影响,所有的实验小鼠都选择雌性)血清中胆汁酸与雌激素水平,让人意外地发现在FXR-/-小鼠虽然胆汁酸淤积,但是雌激素水平没有明显地升高反而降低了约20%。深入研究FXR对肝内雌激素合成代谢关键基因调控。通过比较FXR-/-与WT小鼠肝脏中雌激素代谢关键基因的表达谱,筛查了十多个雌激素代谢基因,结果显示雌激素硫酸转移酶SULT1E1在两者中表达差异极其显著。通过对SULT1E1基因的启动子分析,发现FXR自身并没有直接结合在SULT1E1基因启动子区域,而是通过干扰HNF4a的转录活性和DNA结合能力抑制SULT1E1基因表达。FXR主要调节体内胆汁酸代谢、胆固醇代谢和糖脂代谢,具有典型的核受体转录因子结构。本课题的创新点在于发现胆汁酸也可以上调雌激素水平,胆汁酸激活的FXR抑制SULT1E1基因的表达,从而上调雌激素水平。本基础研究为解释疾病的发病机理提供了新的思路。鉴于FXR受体激动剂已作为治疗原发性胆汁性肝硬化药物进入Ⅲ期临床试验,本研究将拓展其新的药理作用。第二部分：胆汁酸受体FXR通过Wnt/β-Catenin信号通路调控肝癌发病的机制研究在人体生理代谢过程中胆汁代谢被越来越多研究人员所关注,胆汁酸是一种双亲分子,或者说去污剂,也是胆固醇代谢的终末产物。最近研究表明胆汁酸也是一种重要的体内信号转导分子,参与固醇类、糖以及能量代谢等。胆汁通过肝肠循环机制平衡胆汁在体内的水平,防止过多的胆汁滞留体内导致器官病变。肝肠循环大约每6-12 h左右完成一次。一旦胆汁合成运输失调就可能导致肝内胆汁淤积,长期慢性的胆汁淤积就可能产生一定的肝毒性作用,甚至会导致肝细胞或者胆管细胞癌变。胆汁酸在许多情况下是一种促癌因子,特别在肝癌、肠癌和胃癌中。肝癌致死率一直居高不下,而且预后非常差,药物抵抗性特别强。早在上世纪九十年代科研人员就发现胆汁酸可以促进肝癌的发生发展,之后又发现胆汁酸可以促进肝脏再生。在正常的生理条件下,胆汁酸调控肝细胞的功能是受着非常严格的控制,一旦细胞进入癌变阶段Hippo, Wnt/β-Catenin等其他许多信号通路就可能受到胆汁酸的刺激而异常活化最终产生恶性肿瘤。作为内源性胆汁酸感受器的核受体FXR在胆汁酸的代谢平衡中处于重要地位。分泌过多的胆汁酸激活FXR进而上调表达SHP (Small heterodimer partner)然后SHP/HNF4a作为复合体抑制胆汁酸合成限速酶CYP7A1。单独敲除FXR或者SHP 15个月的C57小鼠会产生肝癌,而且并发严重的胆汁淤积现象。如果两个基因同时被敲除,就会导致3个月左右的年轻小鼠也自发形成肝癌。最近研究发现,FXR敲除小鼠自发形成肝癌时,Wnt/β-Catenin信号通路异常活化,Active-β-Catenin在FXR敲除小鼠中高表达。如果给FXR敲除小鼠喂食2%消胆胺(促使胆汁酸排泄)持续3个月。与正常饮食相比,喂食消胆胺的FXR敲除小鼠组肝脏肿瘤大小与个数都显著减少。说明FXR在介导胆汁酸与肝癌的关系中有着重要作用,而且如果只给野生型小鼠喂食胆汁酸并不会产生肝癌,除非联合一些致癌化合物。本课题将从以下几个方面来探究FXR介导胆汁酸信号与Wnt/β-Catenin信号通路在肝癌的发生发展中分子机制。1、在收集18对癌与癌旁人体肝组织,裂解后提取蛋白检测FXR与β-Catenin蛋白水平的变化,结果发现FXR在大部分肿瘤组织是低表达,而β-Catenin在肿瘤组织却是多数上调表达。同时收集9种肝癌细胞系,检测两个蛋白的表达。蛋白质相对定量后作图比较,发现在不同肝癌细胞系FXR与β-Catenin表达水平呈负相关。以上结果可以推测在肝癌的发生发展过程中FXR与β-Catenin之间有可能是一种相互拮抗的关系。2、FXR是核受体家族成员之一,核受体家族其他成员如RAR/RXR, GR, TR, VDR,ER和PPAR可与Wnt/β-Catenin信号通路分子相互作用,参与调控Wnt/β-Catenin信号通路。蛋白质免疫共沉淀,蛋白质荧光共聚焦定位和GST-pull down实验均证实了FXR与β-Catenin之间直接的相互作用。3、利用报告基因检测发现,FXR与β-Catenin相互作用对β-Catenin转录活性负调控。接下来从肿瘤细胞功能学角度研究FXR与β-Catenin之间的关系。选取FXR相对表达量比较高的肝癌细胞系Huh7作为研究对象,慢病毒稳定表达的shRNA下调FXR以后β-Catenin转录活性增强,相应其生长、转移和侵袭能力都提高了。然而在FXR表达量低的高侵袭转移能力的肝癌细胞系HCCLM3’恢复表达FXR,结果发现HCCLM3生长、转移和侵袭能力都受到很强的抑制。综上所述,FXR通过与β-Catenin的相互作用,抑制Wnt/β-Catenin信号通路活化,进而抑制肝癌的发展。这项研究阐明了FXR调控Wnt/β-Catenin信号的分子机制,为开发肝癌的分子靶向治疗打下基础。