鉴于干扰素-γ是动物免疫应答调节中十分关键的细胞因子，国内外对猪淋巴细胞干扰素-γ基因的研究甚少，尚未见到对其在体内外转基因表达及其对动物免疫系统和免疫应答反应的深入研究；而在猪的免疫防御感染和免疫应答调节中干扰素-γ可发挥着重要的作用，因此，我们进行了成华猪淋巴细胞干扰素-γ基因的克隆及其在体内外传基因表达、对小鼠和猪免疫系统和对猪瘟、猪肺疫和猪丹毒三联疫苗及副伤寒疫苗的免疫应答的作用和机理进行了较系统的研究。 首先，我们率先克隆了成华猪淋巴细胞干扰素-γ基因，猪外周血淋巴细胞通过Con A刺激，诱导其表达干扰素-γ基因，用RT-PCR的方法克隆报导了优良地方猪种成华猪淋巴细胞IFN-γ基因(IFN-γ)，并在GenBank数据库中登记(登记号：AF493993)，与来源于Vandenbroedk报道的脾细胞中的干扰素-γ98％同源。其开放阅读框长度为498bp，编码166个氨基酸残基，分子量为19.4kD，等电点为10.29，疏水氨基酸占40.4％，亲水氨基酸占34.9％，碱性氨基酸占15.1％，酸性氨基酸占9.6％。基因的63-136位核苷酸编码23个氨基酸残基的信号肽，137-569位核苷酸编码144个氨基酸残基的成熟片段。 第二，首次将克隆到的猪淋巴细胞干扰素-γ基因亚克隆到真核表达型载体VR1020上，通过菌落PCR的方法在转化子中筛选阳性克隆，用Bam HI酶切初步鉴定重组子，用KpnI确定基因插入相位正确的重组子。得到的重组真核表达质粒转染Cos7细胞株，PT-PCR检测猪淋巴细胞干扰素-γ基因的转录表达；通过猪和小鼠脾淋巴母细胞增殖实验检测猪淋巴细胞干扰素-γ基因真核表达产物的生物学活性。结果显示：通过菌落PCR和酶切分析，得到猪淋巴细胞干扰素-γ基因以正确方向插入的重组真核表达质粒VPIFN-γ。重组质粒VPIFN-γ经脂质体介导转染Cos7细胞，培养不同时间后提取mRNA进行RT-PCR，发现转染细胞RNA中含有与IFN-γ基因对应的mRNA；淋巴母细胞增殖实验证 DJllrtWWd＝4bffftgjC 明猪淋巴细胞干扰素－Y基因重组真核质粒在转染C。S7细胞株后，能够表达出 有生物活性的猪淋巴细胞干扰素－Y 蛋白质，小鼠的脾淋巴母细胞增殖实验表 明猪干扰素－Y 基因可以刺激小鼠淋巴细胞增殖。这些结果表明已成功构建了 能正确表达PIFN－Y的真核表达质粒，表达产物具有正常的生物学活性。 第三，为了探讨增强动物体液和细胞免疫免疫应答的方法，我们首次制备 阳离子脂质体和 PLG纳米颗粒包装 VPIFN Y质粒和自己构建的含有 CpG基 序的pUCcpG，与常规疫苗联合兔疫小鼠，系统地研究了VPIFN－p对小鼠 的细胞和体液免疫水平、对常规疫苗在不同的免疫佐剂协同作用下细胞兔疫和 体液免疫应答的变化情况。本实验结果首次发现：在以VP IFN－Y质粒作为分 子免疫增强剂时，小鼠的总IgG和特异性抗体水平比对照组显著升高；同时， 各种免疫细胞数量和淋巴细胞白细胞介素－2的诱生活性明显增加；pUC一 CPG接种小鼠后，上述各项指标也显著提高，能有效地增强动物的免疫水平， 与常规疫苗共注射时可显著加强对疫苗的免疫应答反应；与阳离子脂质体和纳 米颗粒联合使用，可以大幅度提高实验动物的细胞免疫和体液兔疫水平。实验 结果表明：猪IFN－p基因和pUC18—CpG序列能显著提高动物的细胞和体液 免疫水平，明显增强动物对常规疫苗的细胞免疫和体液兔疫应答反应。 第四，为进一步探讨猪IFN－丁基因和猪几－6、IL－4基因协同作用对猪免 疫效应的影响，我们还首次将阳离子脂质体包装的IFN－Y 基因、IL6、IL、 基因联合PUC18—CPG序列免疫猪，全面检测了猪的体液和细胞兔疫水平，以及 抵御外来强毒的免疫保护效应，结果发现：猪IFN－Y基因单独或协同几－6、 IL－4基因免疫猪后，猪的免疫球蛋白含量、IL－2诱生活性、特异性抗体滴度、 淋巴细胞增殖反应和免疫细胞数均显著增加，能够显著增强免疫猪对常规疫苗 的细胞和体液兔疫应答反应水平；同时能够明显提高免疫动物的兔疫保护反应， 抵抗外来猪瘟强毒的感染。