丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)是带有包膜的正链RNA病毒,主要经血液传播,引起急、慢性丙型肝炎,并可导致肝硬化和肝细胞癌。HCV感染除引起肝脏病变外,还可引起多种肝脏外组织损害,与B细胞淋巴瘤、冷球蛋白血症等多种肝外疾病有关。目前全球HCV感染者约有1.7亿,HCV感染的慢性率高达80%。HCV的基因变异,对宿主细胞内免疫的拮抗作用以及相对低水平表达和复制等均与HCV慢性感染有关。最近的一些研究发现,HCV包膜E2蛋白与CD81分子结合所致免疫细胞的功能紊乱也可能是HCV慢性感染的重要原因,并且与B细胞淋巴瘤以及冷球蛋白血症具有重要相关性。HCV包膜E2蛋白的CD81结合活性还可能与HCV感染难以诱导中和抗体而导致慢性感染有关。一、HCV包膜蛋白E2促进B淋巴细胞活化和增殖的作用机制HCV包膜E2蛋白通过与B淋巴细胞表面上CD81分子的作用,改变了B细胞激活的正常信号转导通路,导致B淋巴细胞非特异性活化。我们构建了HCV包膜E2蛋白的表达质粒,转染细胞表达HCVE2蛋白。将表达的E2蛋白固定在事先包被了E2单抗的酶标微孔板上,然后加入Burkitt淋巴瘤Raji细胞,可观察到该细胞聚集贴附生长。然而用siRNA下调Raji细胞表面CD81的表达,则不能使Raji细胞聚集贴附生长,说明表达的E2蛋白能够与Raji细胞表面的CD81分子结合。进一步我们制备固定化的E2蛋白,并分别用固定化的E2和可溶性E2蛋白刺激Raji细胞,然后分析细胞内蛋白酪氨酸磷酸化的水平。结果表明,固相化的E2蛋白可有效上调Raji细胞内的蛋白酪氨酸磷酸化的水平,而可溶性E2对Raji细胞内的蛋白酪氨酸磷酸化水平则无明显影响。这可能是因为固相化的E2蛋白类似天然的病毒颗粒,在构象上要更接近于天然的病毒颗粒表面E2蛋白,而且固相化后的E2蛋白在单位体积的密度要高于可溶性的E2蛋白单位体积的密度,使其能够更充分的与细胞表面的CD81分子相互接触作用。构建CD81分子siRNA的慢病毒载体,转染293T细胞包装出病毒后感染Raji细胞,流式检测Raji细胞表面CD81分子表达被抑制,进一步用固相化的E2蛋白刺激该CD81表达下调的Raji细胞,则观察到Raji细胞内的蛋白酪氨酸磷酸化水平无明显的变化,这说明E2蛋白对Raji细胞的信号调节是经由CD81分子作用的。固相化的E2蛋白刺激Raji细胞后用western blotting技术检测细胞内凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax蛋白的表达,可以观察到Bcl-2蛋白表达下降,而Bax蛋白表达增加。Bcl-2基因是人体最主要的抗凋亡基因,它编码的蛋白质产物定位于线粒体内膜、内质网膜及核膜上,其主要生物学功能是延长细胞的寿命,增加细胞对各种凋亡刺激因素的抵抗力.它可导致DNA受损的细胞持续生存,突变产物聚集,从而促进肿瘤的发生与发展。Bcl-2相关X蛋白(Bax)具有加速细胞凋亡的功能, Bax可与抗凋亡基因Bcl-2形成异源二聚体,具有抑制Bcl-2,促进细胞凋亡的作用。Bcl-2与Bax两者之间的比例决定了细胞的命运,若Bax占多数,则Bcl-2被抑制,凋亡被诱导,细胞死亡;反之则Bax受到抑制,细胞得以生存。E2蛋白刺激Raji细胞后促进Bcl-2的表达而抑制Bax的表达,这说明E2蛋白能够增强Raji细胞的抗凋亡能力。E2蛋白能够诱导B细胞蛋白酪氨发生酸磷酸化且促进B细胞的抗凋亡的能力,这些可能是E2促进B细胞增殖的重要机制。用流式细胞技术检测固相化HCV E2蛋白刺激的Raji细胞表面CD80、CD86和CD21分子的表达,结果可看到CD80和CD86分子的表达上调,而CD21分子的表达下降,CD80、CD86和CD21是与B淋巴细胞的活化紧密相关的膜表面分子,这说明E2蛋白能刺激Raji细胞的活化,从而也促进Raji细胞的增殖。二、HCV E2蛋白突变体免疫原性分析研究表明HCV包膜E2蛋白可诱导B淋巴细胞蛋白酪氨酸磷酸化,通过上调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,下调促凋亡蛋白Bax的表达而促进B淋巴瘤细胞的增殖,并且还能上调活化分子的表达,说明E2蛋白能通过激活胞内信号转导通路发挥一系列生物学效应。而E2对B细胞的激活可能导致HCV感染难以有效诱导中和抗体,因此,消除E2蛋白的CD81结合活性可能有利于中和抗体的诱导。我们分别将H77株的E2蛋白的第442位苯丙氨酸(F)和529位的色氨酸(W)突变为丙氨酸(A),构建质粒转染细胞,用E2多抗对细胞培养上清以及细胞裂解液中的E2蛋白表达进行检测,结果表明突变对E2的表达和分泌无明显影响。用ELISA分析两种突变的E2蛋白与大肠杆菌表达的Trx(硫氧还蛋白)-CD81 LEL(大胞外环)融合蛋白的结合情况,结果显示,该两个位点的突变体不再具有与CD81大胞外环(LEL)的结合活性;进一步用流式细胞术(FACS)分析两种E2突变体与表达CD81分子的CHO细胞结合情况表明,该两个位点突变的E2蛋白不再具有与膜表面的CD81分子结合的功能。用突变体质粒E2-W529/A和E2-W442/A转染细胞后,免疫荧光检测两株构象依赖性单抗与突变体E2蛋白的反应,结果表明,该两个位点的突变对E2蛋白空间构象无明显影响。将固相化的两种突变体E2蛋白分别刺激Raji细胞,没有检测到细胞内蛋白酪氨酸磷酸化水平发生明显变化,这表明,消除CD81结合活性可消除E2蛋白对Raji细胞胞内信号转导的激活作用。HCV E2蛋白第442和529位氨基酸分别位于两个线性B细胞表位中,其中,前者所在表位抗体具有中和活性,而后者病毒中和活性并不明显。因此,选择529位的突变体进行免疫可有利于保留更多的中和抗体表位。我们将野生E2与突变体E2-W529/A表达质粒分别免疫小鼠,眼眶取血收集免疫小鼠的血清,分别用野生和突变的E2蛋白为靶抗原检测小鼠的抗体动力学,结果表明,两种DNA免疫小鼠血清的E2抗体动力学水平相似,这说明W529/A突变对于E2蛋白的免疫原性无明显影响。524～531位氨基酸残基APTYSWGA为一线性B细胞表位,其抗体能抑制E2蛋白与CD81的结合。我们将该表位与红色荧光蛋白融合,构建表达质粒转染细胞,用免疫荧光分析该表位与小鼠血清的结合,结果表明,W529A的突变部分降低了该表位的免疫原性/抗原性。AP33表位为HCV E2蛋白第412～423位氨基酸残基QLINTNGSWHIN,也为一线性B细胞表位,其在HCV的六个基因型中高度保守,AP33能有效中和HCV的感染性。同样构建该表位与红色荧光蛋白RFP融合表达的质粒,转染细胞用免疫荧光分析其与小鼠血清的结合表明,W529/A突变不影响该表位的抗体应答,野生或突变E2均可诱导针对该表位的抗体。构建11株HCV(涵盖6个基因型)包膜E2蛋白的表达质粒,转染细胞用免疫荧光分析小鼠免疫血清与这些不同株不同基因型E2蛋白的反应,结果表明,E2-W529/A免疫血清可与该11株HCV包膜蛋白发生交叉反应。为了评价免疫血清的中和作用,我们构建了五株HCV包膜蛋白的HCVpp进行中和试验。从结果可见,野生型E2以及E2-W529/A突变体免疫血清均可有效中和这八株HCVpp对靶细胞Huh7.5的感染性,且对同株HCVpp的中和效率无明显差异。进一步我们用JHF-1株HCVcc评价小鼠血清的中和作用,结果表明两种质粒免疫血清均可抑制HCVcc的感染性,抑制效率相似。三、小结1.本研究中用固相化的HCV包膜蛋白E2刺激人B淋巴细胞Raji细胞,可诱导Raji细胞内的蛋白酪氨酸的磷酸化,而用siRNA干扰掉B细胞表面CD81的表达后用E2蛋白再刺激Raji细胞,细胞内酪氨酸磷酸化的水平未发生明显的变化。而且E2蛋白刺激Raji细胞可上调Raji细胞内凋亡相关蛋白Bcl-2蛋白的表达,下调Bax蛋白的表达,并促进膜表面CD80、CD86分子的表达,下调膜表面CD21分子的表达。这些结果表明HCV包膜蛋白E2可通过与CD81分子作用改变B淋巴细胞内信号的转导,从而引起的B细胞的增殖和非特异性激活。2.在此基础上,我们构建了一种E2蛋白突变体,将第529位色氨酸突变为丙氨酸,该W529/A突变体不影响E2蛋白的空间构象,但是消除了与CD81的结合活性。该突变体刺激B淋巴细胞后,对B细胞的胞内蛋白酪氨酸磷酸化水平变化影响不明显。以DNA免疫的方式进行小鼠免疫,一次免疫可使小鼠抗体阳转率达到100%,抗体应答(包括E2总抗体以及针对中和抗体表位的抗体)与天然E2免疫无明显差异,并且能有效诱导HCV交叉中和抗体。由于该突变体对B细胞无另外刺激,不导致B细胞的非特异激活,但可有效诱导中和抗体,因此可望作为HCV疫苗的有效研究方向,可代表一种HCV疫苗的发展策略。