论文部分内容阅读
哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）作为PI3K相关蛋白激酶家族的重要激酶，近年来已经被认为是肿瘤治疗的重要靶点，其中mTORC1通过诱导下游效应蛋白4E-BP1和p70S6K的磷酸化，调控蛋白的翻译合成，并已经证实在多种肿瘤中异常激活，且与肿瘤的恶化、转移密切相关。雷帕霉素（Rapamycin）作为特异性mTORC1抑制剂，可以有效抑制其活性。近年来，雷帕霉素衍生物Everolimus（RAD001），CCI-779和AP23573已经越来越多的应用于临床肿瘤的治疗。然而临床研究显示，Everolimus和CCI-779单独用药时可以延长多种肿瘤患者的生存期，如肾癌、淋巴瘤和黑色素瘤，但是对于大多肿瘤仍部分或完全耐药，单独用药的治疗效果并不理想，而具体的机制尚不清楚。mTOR具有感应上游生长因子、营养和压力的能力，生长因子（如胰岛素）和IGF-1可以通过RTK和PI3K/AKT通路诱导mTORC1的激活；生长因子也可以通过Ras-Raf-ERK通路调节mTORC1的活性，即RTK调控Ras GTPase的激活从而诱导Raf-MEK-EKR-RSK通路中各级联激酶的活性，而ERK和RSK的磷酸化又可以促进mTORC1的激活。而且mTORC1通路受到两条负反馈途径的调控，一个是mTORC1-S6K调控IRS的磷酸化及降解；另一个是mTORC1调控Grb10的磷酸化。由于这两条负反馈途径的存在，使雷帕霉素及其衍生物在抑制mTORC1的同时反馈激活PI3K和ERK，从而导致细胞的耐药。Ras蛋白由人的H-Ras，K-Ras和N-Ras基因编码，然而K-Ras在大约95%的胰腺癌中发生突变，突变的K-Ras导致GTPase的持续激活，进而促使胰腺癌的发展和恶化。本研究我们发现K-Ras突变在介导胰腺癌对Everolimus的耐药中发挥关键的作用，由于K-Ras的突变导致Everolimus诱导的IGF-1-Ras-Raf-ERK通路的反馈激活，并通过体内体外实验证实，抑制突变的K-Ras可以阻断ERK通路的反馈激活，减少胰腺癌的耐药，进而有效增强了Everolimus对细胞及移植瘤的抑制。该结果对改善雷帕霉素及衍生物对胰腺癌的治疗提供新的策略主要的研究结果如下：①Western-blot及免疫组化染色实验发现，人胰腺癌肿瘤组织中mTORC1下游重要底物S6及其磷酸化水平的表达高于正常对照组织，同时应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析（PCR-RFLP）证实胰腺癌组织中K-Ras基因的状态。初步证实胰腺癌中mTOR通路激活，并且与癌基因K-Ras突变无相关性，为mTOR抑制剂——雷帕霉素及衍生物用于胰腺癌治疗奠定基础。②首先应用PCR-RFLP验证4株胰腺癌细胞系中K-Ras的基因型（2株野生型和2株突变型）；然后应用细胞增殖、细胞平板克隆形成和流式细胞术检测Everolimus对胰腺癌细胞生长和细胞周期的影响，比较野生型和突变型对Everolimus敏感性的区别；最后应用Western-blot以及免疫共沉淀检测经Everolimus处理后胰腺癌细胞相关蛋白的变化，初步证实K-Ras突变细胞系经Everolimus处理后，Raf/MEK/ERK通路被激活而引起耐药。③通过Western-blot证实索拉菲尼联合Everolimus用药时可明显降低ERK磷酸化的激活；然后进行细胞增殖分析以及细胞平板克隆形成分析检测联合应用索拉菲尼与Everolimus可逆转K-Ras突变胰腺癌细胞对Everolimus的耐药，表明K-Ras/Raf/ERK可能参与K-Ras突变胰腺癌细胞系对Everolimus的耐药。④构建稳定转染shRNA的K-Ras低表达细胞系，发现K-Ras低表达可增强Everolimus对K-Ras突变细胞系PANC-1增殖的抑制以及G1细胞周期阻滞；然后在稳定转染K-Ras shRNA的PANC-1细胞系中过表达K-RasG12D，发现恢复突变K-Ras表达可再次导致K-Ras低表达PANC-1对Everolimus耐药。进一步明确了突变的K-Ras可引起细胞对Everolimus耐药的机制。⑤通过Western-blot检测经多种细胞生长因子刺激的PANC-1细胞，发现只有IGF-1可以介导由Everolimus引起的ERK磷酸化激活。然后应用IGF-1抑制剂—NVP-AEW541与Everolimus共同作用，Western-blot检测证实ERK磷酸化水平下调。最后应用生长因子IGF-1刺激K-Ras低表达的PANC-1及其空载体对照，在Everolimus处理后检测Brdu掺入比例变化以及ERK磷酸化水平，进一步明确了Everolimus引起的K-Ras突变细胞系中ERK信号通路的反馈激活是与表面的IGF-1受体所介导的。⑥构建空载体对照及K-Ras低表达PANC-1裸鼠胰腺癌移植瘤模型，体内实验证实K-Ras低表达可逆转K-Ras突变胰腺癌移植瘤对Everolimus的耐药，然后应用Western-blot及免疫组化染色检测给药前后p-S6，p-ERK变化以及不同处理组中K-Ras的表达水平。进一步阐明抑制突变的K-Ras可以阻断ERK通路的反馈激活，减少胰腺癌的耐药，进而有效增强Everolimus对细胞及移植瘤的抑制。该结果对改善雷帕霉素及衍生物对胰腺癌的治疗提供新的策略。结论：通过本课题的研究，首次证实人胰腺癌组织中mTORC1过度激活，且与K-Ras的基因状态无关，同时我们发现Everolimus可诱导K-Ras突变胰腺癌细胞系中ERK的激活。利用基因沉默技术消减K-Ras的表达可阻断Everolimus诱导的ERK通路，从而逆转耐药细胞的反应，并通过体内实验证实抑制突变的K-Ras可以有效改善Everolimus的治疗效果。最后证实IGF-1R作为重要的受体酪氨酸激酶（RTK）参与介导Everolimus引起的ERK信号通路的反馈激活。我们的研究揭示了K-Ras突变参与了胰腺癌细胞对Everolimus的耐药，初步阐明了通过IGF-1R/Ras/c-Raf通路诱导ERK磷酸化从而导致K-Ras突变胰腺癌细胞对Everolimus耐药的分子机制，明确应用c-Raf抑制剂索拉菲尼联合Everolimus可以逆转胰腺癌的耐药，为改善Everolimus的临床联合用药治疗提供新的靶点。