论文部分内容阅读
PD-1分子属免疫球蛋白超家族成员,人PD-1分子为含有288个氨基酸的I型跨膜糖蛋白。PD-1主要表达于活化的T细胞、B细胞、NK细胞、DC细胞等。PD-1与其配体PD-L1、PD-L2相结合,发挥负性调控作用,参与维持机体免疫稳态。PD-1/PD-Ls免疫调节功能异常参与了自身免疫疾病和肿瘤等的重要病理机制。本文主要研制鼠抗人PD-1单克隆抗体,对其生物学功能进行鉴定,以期为PD-1/PD-Ls途径的研究提供研究工具和实验依据。第一部分构建人PD-1基因转染细胞株目的:构建人PD-1基因转染细胞株,以用于PD-1单克隆抗体的研制。方法:将重组逆转录病毒表达载体p EGZ-term-R/PD-1以脂质体转染法转染293T细胞,收集具有感染能力的病毒上清,感染L929细胞,经G418筛选后,采用流式细胞术和Western Blot方法鉴定该细胞株PD-1分子的表达。结果:获得一株稳定表达人PD-1分子的基因转染细胞株L929/PD-1。结论:成功构建稳定表达人PD-1分子的基因转染细胞株,为研制PD-1单克隆抗体提供免疫原。第二部分鼠抗人PD-1单克隆抗体制备及鉴定目的:研制PD-1单克隆抗体为探讨PD-1/PD-Ls途径建立研究工具。方法:采用稳定表达人PD-1基因转染细胞株L929/PD-1,免疫BALB/c小鼠,采用常规B淋巴杂交瘤技术,经HAT培养筛选、间接免疫荧光分析,获得一株持续稳定分泌鼠抗人PD-1单克隆抗体的杂交瘤细胞株15D9;采用快速定性试纸法鉴定单克隆抗体类型;利用流式细胞术检测竞争结合位点、抗体效价;采用细胞免疫化学实验鉴定15D9对PD-1分子的识别。结果:获得一株稳定分泌抗人PD-1单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为15D9;15D9重链为Ig G1,轻链为κ链;竞争结合实验结果显示单抗15D9与单抗6E1识别相似位点;抗体效价结果显示,0.3μg/test可用于间标流式细胞术检测,1μg/test可用于直标流式细胞术检测;细胞免疫化学实验结果显示,15D9可特异性识别PD-1分子。结论:成功获得一株稳定分泌抗人PD-1单克隆抗体的杂交瘤细胞株15D9,可用于免疫荧光标记、流式细胞术和免疫组化实验。第三部分鼠抗人PD-1单克隆抗体的阻断功能鉴定目的:通过观察单抗15D9在PBMC活化过程中的作用,初步鉴定单抗15D9的生物学功能。方法:采用激发型CD3单克隆抗体包被,联合激发型CD28单克隆抗体活化PBMC,于24 h、48 h、72 h检测PD-1和PD-L1分子的表达。加入单抗15D9后,观察PBMC的形态变化,细胞计数法检测PBMC数量变化。采用流式细胞术检测CD69、CD25在24 h、48 h和72 h的表达水平。采用ELISA检测在96 h时IL-2和IFN-γ的分泌量。结果:激发型CD3单克隆抗体联合激发型CD28单克隆抗体活化PBMC后,PBMC表达PD-1和PD-L1分子。加入单抗15D9后,CD3+CD28+15D9组与CD3+CD28+Ig G组相比,PBMC集落直径增大、集落数量增多,PBMC的CD69、CD25表达增高,分泌的IFN-γ升高。结论:激发型CD3单克隆抗体联合激发型CD28单克隆抗体可活化PBMC,加入单抗15D9后PBMC活化程度增强,表明15D9是一株具有阻断功能的单克隆抗体。