近年来一些研究显示银杏叶提取物（ginkgo bioba extract，GBE）可改善糖尿病肾脏功能和结构变化，但机制还不是很清楚。组织型转谷氨酰胺酶（tissue transglutaminases，tTG）可催化蛋白质谷氨酰胺残基或聚胺与赖氨酸残基之间的转谷氨酰胺反应，使蛋白质交联，从而抵抗基质降解酶的水解作用，引起细胞外基质积聚，而糖尿病肾病(Diabeticnephropathy，DN)基本病变是细胞外基质积聚。糖尿病病人及动物模型肾小球中tTG表达和活性显著增加，提示tTG参与其细胞外基质积聚的过程。本研究目的即探讨银杏叶提取物的肾脏保护作用是否与tTG有关及其中的机制，并分别从细胞增殖和ECM积聚的角度对GBE的不同成分进行筛选。实验一（第2章）银杏叶提取物对糖尿病大鼠肾脏tTG表达的影响链脲佐菌素（Streptozotocin，STZ）(50mg/kg)复制糖尿病大鼠模型，部分给予GBE100mg/kg，正常大鼠做为空白对照，12w后观察GBE对糖尿病大鼠的干预作用。结果显示与糖尿病组比较，给予GBE的大鼠尿蛋白降低（P<0.05），PAS染色阳性物质（主要为细胞外基质成分）减少，tTG的表达明显降低（P<0.01）。提示GBE的肾脏保护作用可能与下调tTG有关。实验二（第3章）银杏叶提取物对高糖诱导的大鼠系膜细胞tTG过表达的影响及TGF-β、CTGF在其中的作用机制体外培养大鼠肾小球系膜细胞HBZY-1，通过ELISA检测高糖和不同浓度GBE作用下HBZY-1细胞组织型转谷酰胺酶（tissue transglutaminases，tTG）、转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）、结缔组织生长因子（connective tissue growth-factor，CTGF）、胶原Ⅳ(collagen，ColⅣ)、纤连蛋白(fibronectin，FN)含量，结果显示GBE在低浓度（0.39μg/ml）就对tTG、TGF-β、CTGF、FN、Col Ⅳ表达有降低作用，大致呈剂量依赖性，且分析发现FN、ColⅣ含量均与tTG、TGF-β、CTGF均密切相关。Western Blot实验也发现GBE能抑制tTG蛋白表达，且这种作用呈剂量依赖。为了探讨tTG与TGF-β、CTGF的关系，我们用RNA干扰技术分别沉默高糖培养的HBZY-1细胞TGF-β、CTGF表达，结果显示阴性siRNA组tTG表达水平无改变，TGF-βsiRNA干扰后显著降低高糖诱导的tTG蛋白表达（P<0.01），CTGFsiRNA干扰后tTG蛋白表达变化不明显，GBE+TGF-βsiRNA较TGF-βsiRNA干扰组tTG蛋白变化不明显GBE+CTGF siRNA较CTGF siRNA干扰组tTG蛋白明显降低（P<0.01），提示高糖诱导的tTG蛋白过表达主要由TGF-β1介导，而银杏叶提取物的干预作用也主要由TGF-β1所介导。实验三（第4章）银杏叶提取物有效成分筛选首先用MTT法检测浓度分别为0、3.125μg/ml、6.25μg/ml、12.5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml的各种银杏叶提取物成分（总银杏叶提取物、总黄酮、总内酯、总黄酮水解物、槲皮素、山奈酚、异鼠李素、银杏内酯A、B、C）对高糖（30Mm）诱导的大鼠肾小球系膜细胞增殖的影响，结果显示除苷元成分槲皮素，山奈酚，异鼠李素及总黄酮水解物外，其它各种组分包括总银杏叶提取物、总黄酮、总内酯、内酯A、B、C均无强的细胞抑制作用，总银杏叶提取物（金纳多）仅在高浓度状态下（50μg/ml）对系膜细胞的增殖起抑制作用，总黄酮的增殖抑制作用要强于总银杏叶提取物，25μg/ml即有抑制作用，内酯C在50μg/ml可抑制增殖外，对于这些无强抑制细胞增殖作用的组分，我们又检测了它们对高糖作用下的系膜细胞ECM积聚的影响，实验浓度设计为0、0.05、0.5、5、50μg/ml，总银杏叶提取物（金纳多）、总黄酮在一定浓度范围内（0.5～50μg/ml）对高糖作用下的系膜细胞ECM积聚有缓解作用。总内酯仅在50μg/ml时对ColⅣ含量有抑制作用，内酯A、B无明显抑制ECM积聚的作用，内酯C仅在50μg/ml时对ColⅣ和FN含量有所抑制。根据研究结果得出以下结论：（1）银杏叶提取物对糖尿病大鼠肾脏具有保护作用。（2）银杏叶提取物能缓解糖尿病大鼠肾脏ECM积聚，机制可能与其下调tTG的表达有关。（3）银杏叶提取物（金纳多）抑制高糖诱导的大鼠肾小球系膜细胞ECM积聚（0.39μg/ml-50μg/ml），并且呈浓度依赖性。ECM成分FN、Col Ⅳ的含量与tTG、TGF-β、CTGF含量均密切相关。（4）高糖诱导的系膜细胞tTG蛋白过表达主要由TGF-β介导，而银杏叶提取物对tTG的干预作用也主要由TGF-β所介导。（5）银杏叶提取物（金钠多）仅在高浓度状态下（50μg/ml）抑制高糖诱导的肾小球系膜细胞增殖而低浓度（自0.5μg/ml起）时抑制系膜细胞ECM积聚。（6）银杏叶提取物中总黄酮在抑制细胞增殖和ECM积聚方面起主要作用，总内酯无明显效果。总黄酮作用方式同样是高浓度状态下对肾脏系膜细胞增殖有抑制作用，低浓度（自0.5μg/ml起）时抑制肾脏系膜细胞ECM含量。（7）苷元抑制系膜细胞增殖的作用远远强于糖苷。苷元单体槲皮素，山奈酚，异鼠李素及总黄酮水解物明显抑制肾脏系膜细胞增殖，并且具有浓度依赖性。创新点：1.本研究首次从tTG诱导ECM积聚的角度来研究银杏叶提取物对大鼠糖尿病肾病的保护作用，并应用RNA干扰技术来探讨TGF-β、CTGF与tTG的在糖尿病肾病中的作用机制。研究显示银杏叶提取物能缓解大鼠糖尿病肾脏ECM积聚，机制与其下调tTG的表达有关。而银杏叶提取物对tTG的干预作用主要由TGF-β所介导。2.本实验首次从高糖培养的系膜细胞增殖和ECM积聚角度对银杏叶提取物不同成分进行筛选，结果发现总银杏叶提取物在高浓度时（50μg/ml）以抑制细胞增殖作用为主，低浓度（自0.5μg/ml起）时以抑制ECM积聚作用为主，GBE中起主要作用的是银杏黄酮，并且苷元的作用远远大于糖苷。