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研究背景和目的动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)是一类发生在动脉血管壁的慢性进行性炎症反应性疾病,是众多心脑血管疾病共同的病理基础,严重危害人类健康。血管内皮细胞损伤、平滑肌细胞增殖及巨噬细胞转化为泡沫细胞是粥样斑块形成的三个最为关键环节,其中巨噬细胞转化为泡沫细胞是AS发生的始动环节。国内外大量研究表明,高胆固醇血症、高血压、糖尿病、高同型半胱氨酸血症等是AS致病性的危险因素,血浆非对称性二甲基精氨酸(asymmetric dimethylarginine, ADMA)与这些危险因素密切相关,被认为是一个新的心血管疾病的危险因子。ADMA是内皮源性一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, NOS)竞争性抑制剂。正常情况下人体血浆ADMA不足以抑制NOS活性,但在机体应激损伤时,血浆ADMA浓度则会明显升高。高浓度的ADMA可抑制NO合成、损伤血管内皮、促进VSMCs增生,但在巨噬细胞转化为泡沫细胞中的作用研究相对较少,其具体机制尚不明确。NOS是NO生物合成的关键限速酶,分为两类：持续表达型(constitutive nitric oxide synthase, cNOS)和诱导型(inducible nitric oxide synthase, iNOS)。cNOS广泛存在于正常的组织细胞中,iNOS在正常情况下低表达甚或不表达,但在受到各种刺激时可诱导表达。血凝素样氧化低密度脂蛋白受体1(lectin like oxidized low density lipoprotein receptor-1, LOX-1)是氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein, oxLDL)的特异受体,在结构上与巨噬细胞经典的清道夫受体不具有同源性,属于E型清道夫受体。巨噬细胞通过清道夫受体无负反馈性地吞噬大量氧化低密度脂蛋白,导致细胞内脂质堆积,形成泡沫细胞。研究表明,ADMA可促进巨噬细胞LOX-1表达,但具体机制尚不清楚。iNOS和LOX-1的基因启动子区都含有核因子-κB (nuclear factor kappa B, NF-κB)结合位点,能够与核蛋白特异结合调节下游基因转录。NF-κB是一种具有基因转录多项调控作用的转录因子,广泛存在于各种细胞中。本研究拟采用分子生物学实验方法,分别在细胞水平和组织水平上探讨在动脉粥样硬化形成过程中,ADMA影响iNOS、LOX-1表达的机制,是否是通过激活NF-κB实现的。方法1.体外细胞学实验健康雄性Wistar大鼠50只。分离培养大鼠腹腔巨噬细胞。实验分组及处理：①正常对照组：以含10% FBS DMEM培养液与巨噬细胞共孵育；②oxLDL组：在巨噬细胞培养液中加入oxLDL(终浓度50mg/L)；③A+O组：在巨噬细胞培养液中先加入ADMA(终浓度15μmol/L)共孵育2h后,再加入oxLDL(终浓度50mg/L)；④P+A+O组：在巨噬细胞培养液中先加入PDTC(终浓度25μmol/L)共孵育30min后,再加入ADMA(终浓度15μmol/L)共孵育2h,最后加入oxLDL(终浓度50mg/L)。②③④组细胞在加入oxLDL后,再继续孵育48h。然后分别收集各组细胞和培养液,测定细胞内胆固醇含量及培养液NO水平和iNOS活性,分别提取细胞总RNA、总蛋白及核蛋白。以实时荧光定量PCR和Westen blot分别检测iNOS、LOX-1的mRNA和蛋白表达,以Actin为内参进行标化；以凝胶电泳迁移率变动分析(EMSA)和增强化学发光法(ECL)检测各组NF-κB活性。每组重复3次。2.动物实验：健康雄性Wistar大鼠50只,随机分为四组：①正常对照组(n=10)：标准饲料喂养。②H组(n=12)：高脂饲料喂养。③A+H组(n=14)：高脂饲料喂养,给予ADMA [0.2mg/(kg·d)]灌胃,每日一次。④P+A+H组(n=14)：高脂饲料喂养,给予ADMA [0.2mg/(kg·d)]灌胃,每日一次；PDTC [40mg/(kg·d)]腹腔注射,每日一次。正常对照组、H组均给予等体积的生理盐水灌胃和腹腔注射,A+H组给予等体积的生理盐水腹腔注射。饲养满18周后麻醉大鼠,采血检测大鼠血清NO及iNOS活性；取胸主动脉做病理切片,观察其病理变化。分别以实时荧光定量PCR和Westen blot检测iNOS、LOX-1的mRNA和蛋白表达,以Actin为内参进行标化；以凝胶电泳迁移率变动分析(EMSA)和增强化学发光法(ECL)检测各组NF-κB活性。每组重复3次。结果1.体外细胞学实验：①oxLDL组和A+O组巨噬细胞内胆固醇含量较正常对照组明显增加(均为P<0.05),且A+O较oxLDL组升高更明显(P<0.05),而P+A+O组胆固醇含量较A+O组降低(P<0.05)。②与正常对照组和oxLDL组相比,A+O组NO含量降低(P<0.05或P<0.01)：P+A+O组NO含量较A+O组显著升高(P<0.05)。③与正常对照组和oxLDL组相比,A+O组iNOS活力明显升高(均为P<0.05), P+A+O组iNOS活力较A+O组明显降低(P<0.05)。相关分析显示：NO含量和iNOS活力呈显著负相关(r=-0.773,P<0.05)④与正常对照组和oxLDL组相比,A+O组iNOS mRNA和蛋白表达量显著增加,其差异均有显著性(分别为P<0.01和P<0.05)；P+A+O组iNOS mRNA和蛋白表达较A+O组明显降低(P<0.05)。⑤A+O组LOX-1 mRNA和蛋白表达较正常对照组和oxLDL组增强,其差异均有显著性(均为P<0.05)；与A+O组相比,P+A+O组LOX-1 mRNA和蛋白表达明显降低,两组差异有显著性(P<0.05)。⑥A+O组NF-κB活性较正常对照组和oxLDL组明显增强,其差异均有显著性(均为P<0.05)；与A+O组相比,P+A+O组NF-κB活性明显降低,两组差异有显著性(P<0.05)。⑦相关分析：NF-κB活性与iNOS mRNA和蛋白表达量呈正相关(相关系数r分别为0.82、0.81)；NF-κB活性与LOX-1 mRNA和蛋白表达量呈正相关(相关系数r均为0.82)。2.动物体内实验：①主动脉病理切片HE染色显示：正常对照组血管内膜光滑、完整,未见空泡形成；H组血管内膜毛糙、但尚完整、有少量空泡形成；A+H组血管内膜断裂,血管中层SMCs增生明显,且排列紊乱,内膜层与中膜层有大量空泡形成；P+A+H组血管内膜完整,SMCs增生程度较A+H组明显减轻,空泡数量也较A+H组明显减少。②与对照组和H组比较,A+H组大鼠血清NO水平和iNOS活性明显升高,差异均有显著性(均为P<0.05),P+A+H组NO水平和iNOS活性较A+H组明显降低(均为P<0.05)。相关分析显示,NO水平和iNOS活性呈正相关(r=0.68,P<0.05)。③与对照组和H组相比,A+H组大鼠主动脉iNOS mRNA和蛋白表达量显著增加,(分别为P<0.01和P<0.05), P+A+H组iNOS mRNA和蛋白表达量较A+H组明显降低,两组相比差异有显著性(P<0.05)。④与对照组和H组相比,A+H组大鼠主动脉LOX-1 mRNA和蛋白表达量显著增加,(均为P＜O.05), P+A+H组LOX-1 mRNA和蛋白表达量较A+H组明显降低,两组相比差异有显著性(P<0.05)。⑤A+H组NF-κB活性较正常对照组和H组明显增强,其差异均有显著性(均为P<0.05)；与A+H组相比,P+A+H组NF-κB活性明显降低,两组差异有显著性(P<0.05)。⑥相关分析：NF-κB活性与iNOSmRNA和蛋白表达量呈正相关(相关系数r分别为0.85、0.87)；NF-κB活性与LOX-1mRNA和蛋白表达量呈正相关(相关系数r分别为0.79、0.81)。结论ADMA能够通过激活NF-κB上调iNOS和LOX-1的表达,从而促进AS的发生发展。