【摘 要】
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落叶松（Larix kaempferi）具有抗逆性强、快速成林、抗病虫害及生态效益良好等特点,是我国重要的纸浆材及建筑材树种。随着全球森林覆盖率的下降及社会经济发展对林木需求的日益增长,通过分子改良策略培育落叶松优良品种、加快造林工程的相关基础研究及应用实践工作受到研究者越来越多的关注。基因组编辑技术的出现给落叶松基因组功能基础研究及分子育种实践带来了新机遇,但由于落叶松分子生物学基础研究及基因组
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落叶松（Larix kaempferi）具有抗逆性强、快速成林、抗病虫害及生态效益良好等特点,是我国重要的纸浆材及建筑材树种。随着全球森林覆盖率的下降及社会经济发展对林木需求的日益增长,通过分子改良策略培育落叶松优良品种、加快造林工程的相关基础研究及应用实践工作受到研究者越来越多的关注。基因组编辑技术的出现给落叶松基因组功能基础研究及分子育种实践带来了新机遇,但由于落叶松分子生物学基础研究及基因组操作实践起步较晚,目前还没有落叶松基因组编辑工作的成功报道。本研究基于落叶松基因组结构及CRISPRCas9核酸酶工作机制,致力于构建落叶松CRISPR-Cas9基因组编辑系统,以期实现落叶松内源基因的有效编辑,为落叶松基因组功能基础研究、分子育种实践提供有力分子操纵工具。本文主要研究内容及结果如下:1、通过落叶松原生质体瞬时表达体系,确认在落叶松内源细胞中具有高转录活性的启动子元件Lar PE004,并以水稻为测试材料进行瞬时表达和稳定转化证明Lar PE004具备物种通用性且可在稳定转化植物中工作。克隆鉴定了转录因子编码基因、激素类相关基因和micro RNA编码基因三类落叶松内源基因的序列信息,为可靠测试落叶松CRISPR-Cas9系统提供了明确靶标;2、基于转录单元类型、启动子元件等不同功能分类,构建不同类型CRISPRCas9系统,并通过落叶松原生质体瞬时表达体系和扩增子高通量测序策略测试编辑活性。实验结果证明:单转录单元CRISPR-Cas9（STU-Cas9）单位点编辑效率（6.1%-11.0%）明显优于双转录单元CRISPR-Cas9（TTU-Cas9）（1.8%-2.2%）;Lar PE004启动子驱动的STU-Cas9系统单位点编辑效率（6.1%-11.0%）均优于Ca MV 35S（1.8%-2.0%）和Zm Ubi（2.7%-3.5%）启动子驱动的STU-Cas9系统;3、基于Cas9蛋白突变体SpRY可广谱性识别多种PAM位点的特性,构建了Lar PE004::STU-SpRY系统,有效实现了落叶松多类型PAM位点的编辑,平均编辑效率最高可达到60%,有效拓展了STU-Cas9介导的落叶松基因组编辑体系;4、确认STU-Cas9系统具有良好的共编辑能力,其中:Lar PE004::STU-Cas9的四位点共编辑效率为1.0%-8.2%;Lar PE004::STU-SpRY针对不同PAM序列四位点共编辑效率为1.7%-8.6%;PAM序列均为5’-NGG-3’的四位点共编辑中,Lar PE004::STU-Cas9系统的共编辑活性整体略优于Lar PE004::STU-SpRY系统。
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