烟草根腐病、黑胫病生防菌鉴定及作用机制研究

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本研究以烟草根腐病和烟草黑胫病为研究对象,筛选到对这两种病害均具有良好生防作用的菌株SN53,对其进行了分类鉴定,研究了其发酵条件、抑菌谱,对其活性成分进行了提取并基于非靶向代谢组学分析出主要代谢产物,利用高效液相色谱进行了验证,对其中分离到的主要代谢产物茴香霉素进行了抑制烟草根腐病菌、黑胫病菌作用机制的研究。具体结果如下:1.生防菌株SN53经鉴定为淀粉酶产色链霉菌(Streptomyces diastatochromogenes),其对多种病原菌有抑制作用。通过平板对峙试验和发酵液抑菌活性测定试验,筛选到1株对烟草根腐病菌和烟草黑胫病菌均具有良好生防作用的链霉菌,命名为SN53。结合形态学观察、培养特性、生理生化特性及分子生物学鉴定结果,将SN53鉴定为淀粉酶产色链霉菌;SN53菌株抑菌谱较广,对10种植物病原菌均有不同程度的抑制作用。另外,还有两株生防细菌对烟草根腐病菌有良好的生防作用,经鉴定分别为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)。2.菌株SN53理化性质、活性成分及非靶向代谢组的分析与验证结果表明,其发酵液中含有茴香霉素和环苯丙氨酸-脯氨酸两种杀菌活性物质。通过测定SN53发酵液在不同发酵时间的抑菌活性,确定了最佳发酵时间为第6 d;对SN53发酵液的理化性质研究表明,发酵液中的活性物质在中性或弱碱性条件下具有生物活性,较耐高温、耐贮藏,具有较好的稳定性,在中性、低温、避光的条件下保存效果最佳;对菌株SN53发酵液活性物质进行了分离纯化,基于超高效液相色谱-四极杆静电场轨道阱高分辨质谱(UHPLC-Q-EXACTIVE-MS)的非靶向代谢组学测定了粗提物中的代谢产物,对其中检测出的茴香霉素和环苯丙氨酸-脯氨酸两种物质利用高效液相色谱进行了验证。根据两种物质的标准品在不同浓度下的峰面积制作标准曲线,得到线性方程。3.菌株SN53代谢产物茴香霉素具有较高的生物活性,对烟草根腐病菌、黑胫病菌的EC50分别为1556.36μg/ml、40.74μg/ml,并利用转录组学对其作用机制进行了初步研究。通过抑菌试验测定发现茴香霉素对烟草根腐病菌、黑胫病菌均有良好的抑菌效果,表明茴香霉素是生防菌的活性物质之一。茴香霉素处理后,两种病原菌菌丝均变形扭曲。采用菌丝生长速率法测定茴香霉素对烟草根腐病菌、黑胫病菌的抑制活性,绘制毒力回归方程,计算出EC50分别为1556.36μg/ml、40.74μg/ml。对茴香霉素的抑菌谱进行测定,发现茴香霉素对试验的7种病原菌有抑制效果。用茴香霉素处理烟草根腐病菌、黑胫病菌菌丝后进行转录组测序,分析发现烟草根腐病菌的差异表达基因为1453个,上调的基因有735个,下调的基因有718个,通过GO富集分析有1041个差异表达基因被注释,在生物学过程、分子功能和细胞组分这三个一级分类中。烟草黑胫病菌的差异表达基因为1913个,上调的基因有861个,下调的基因有1052个,通过GO富集分析有894个差异表达基因被注释,在生物学过程、分子功能和细胞组分这三个一级分类中。进一步分析差异表达基因,推测茴香霉素可以使根腐病菌的细胞壁被破坏从而导致致病力下降,而对黑胫病菌细胞壁的影响则是一个复杂的过程。
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