目的:缺血性脑血管病是一种常见的神经系统疾病,具有较高的致残率和致死率。除了超早期的溶栓治疗和康复外没有任何治疗措施能够证明对患者有益。因此,脑缺血患者受损神经功能的修复成为研究的重点。目前认为最有前景的方法是细胞替代治疗。造血干细胞(hematopoietic stem cells, HSCs)可塑性使临床HSCs移植治疗脑梗死成为可能。本研究通过观察移植细胞存活、迁移、分化情况,以及移植前后神经功能缺损评分、梗死体积的变化,验证HSCs能否分化为神经干细胞、神经细胞以及血管内皮细胞,重建神经环路及微循环。并探讨神经生长因子(nerve growth factor, NGF)对移植HSCs的存活、分化以及神经功能改善的影响。同时比较HSCs内源性动员和外源性移植的治疗效果,寻找脑梗死治疗更有效方法。方法1通过皮下注射重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)刺激骨髓干细胞入血,经密度梯度离心方法分离HSCs。细胞免疫组化检测HSCs表面特异性抗原CD34。利用(5-溴脱氧尿嘧啶) Brdu进行细胞标记。选取280~320g雄性SD大鼠,根据改良后的Longa线栓法建立大鼠大脑中动脉脑栓塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO)模型,模型制作成功后7天,随机分为五组:HSCs组(A组)、HSCs+ NGF组(B组)、NGF组(C组)、对照组(D组)、HSCs动员组(E组)。每组20只大鼠(统计学分析各组大鼠的体重、移植前神经功能缺损评分无显著性差异)。以前囟后方1.2mm,中线向右旁开3mm,硬膜下4mm为移植位点。A组:注入标记Brdu的1×106个HSCs;B组:注入标记Brdu的1×106个HSCs+NGF 200ng;C组:注入NGF 200ng;D组:给予等量PBS液。E组模型制作成功7天后皮下注射rhG-CSF 20ug/Kg,第二天rhG-CSF 10ug/Kg皮下注射,连续应用5天。观察移植后1、2、3、4周通过神经功能缺损评分(Neurological Severity Scores,NSS)了解移植前后神经功能改善情况。于移植后1、4周经CD34、Nestin、VEGF、vWF抗原免疫组化了解局灶性脑梗死HSCs移植后细胞的分化、增值、分布情况。并通过Brdu/CD34、Brdu/Nestin、Brdu/Nse、Brdu/vWF双染免疫组化了解移植细胞存活、迁移、分化情况。移植后4周经TTC染色观察梗死体积。2统计学分析。数据计量资料采用T检验、单因素方差分析,应用SAS 6.12统计软件处理。P<0.05为有统计学意义。结果1每只大鼠可以采集5.24-7.96×106个细胞,CD34阳性细胞占采集细胞数的91.5%。2 HSCs的Brdu的标记率为98%。3移植前,台盼蓝排斥试验检测HSCs的活细胞率为100%。4大鼠神经功能改善情况移植后1周,E组神经功能有所改善(P<0.05)。A、B、C、D组神经功能改善无显著性差异;移植后2周, A、B、C、E组神经功能较D组有明显改善(P<0.05),E组改善优于A、B、C组(P<0.05),A、B、C组神经功能改善无显著性差异;移植后3周,A、B组神经功能改善优于D组(P<0.05),A组与B组差异无显著性,C、D、E组神经功能改善无显著性差异;移植后4周,A、B、C、E组神经功能改善优于D组(P<0.05),B>A>E>C>D。5免疫组化结果5.1第1周5.1.1五组均可见CD34阳性细胞。A、B组CD34阳性细胞较D组多(P<0.05);B组多于A组(P<0.05);C组、D组、E组间无显著性差别。5.1.2 A、B、C组Nestin阳性细胞较D组多(P<0.05);B组阳性细胞多于A组(P<0.05);A组的阳性细胞明显多于C组(P<0.05);E组与D组无显著性差异。5.1.3 A、B、C、E组vWF阳性细胞明显多于D组(P<0.05)。B组比A组多,A组多于E组(P<0.05);C组与E组无显著性差异。5.1.4 A、B、C组VEGF表达较D组高(P<0.05);A、B两组VEGF呈强表达,与C组有显著性差异(P<0.05);E组与D组无显著性差异。5.1.5移植后第1周时五组vWF阳性细胞随VEGF的表达增强而增多,两者呈直线相关。5.2第4周5.2.1五组均未见CD34阳性细胞。较第1周有显著性差别。5.2.2 A、B、C组Nestin阳性细胞比D多(P<0.05);A、B两组阳性细胞较C组多(P<0.05),A组与B组无显著性差异;E组与D组无显著性差异。A、B、C、D、E组第4周时Nestin阳性细胞较第1周时减少,差别有显著性(P<0.01)。5.2.3 A、B、C、E组vWF阳性细胞较D组明显增多(P<0.05);A=B>C=E>D。A、B、C、E组第4周时vWF较第1周时明显增加(P<0.01)。D组无显著性差异。5.2.4 A、B、C组VEGF表达较D组高(P<0.05);B组VEGF的表达高于A组,A组比C组高(P<0.05);D组与E组无显著性差异。A、C两组第4周时VEGF表达较第1周减弱,差异有显著性;B、D、E组无显著性差异。6植入脑内的HSCs存活、分化情况6.1第1周6.1.1 A、B两组Brdu/CD34阳性细胞分别为6.77±1.24、10.10±1.71,A组与B组有显著性差异(P<0.01)。6.1.2在梗死灶周围及注射位点附近有Brdu/Nestin双染阳性细胞表达。A组(9.57±1.95)与B组比较(13.17±2.61) (P<0.01),差异有显著性。6.1.3在梗死灶周围区域A、B两组均有散在的Brdu/Nse阳性细胞表达(8.27±3.58、12.00±1.85),A组较B组少(P= 0.0002)。6.1.4 A、B两组有极少的Brdu/vWF双染阳性细胞(1.03±0.29、2.47±0.78),两者有显著性差异(P<0.01)。6.2第4周6.2.1 A、B两组均未见Brdu/CD34双染阳性细胞。较第1周时有显著减少(P<0.01)。6.2.2 Brdu/Nestin双染细胞主要存在于梗死灶周围,但在同侧半球其它部位也有散在分布。A、B两组双染阳性细胞分别为5.67±1.63、5.47±0.60,无显著性差异。A、B两组第4周时的Brdu/Nestin双染细胞较第1周明显减少,差别有显著性(P<0.01)。6.2.3 Brdu/Nse阳性细胞分别为,B组(22.10±4.37)、A组(17.43±3.78),无显著性差异。A、B组Brdu/Nse细胞较第1周增加,差别有显著性(P<0.01)。6.2.4 A、B两组Brdu/vWF双染阳性细胞分别为3.37±1.34、4.20±0.68,差别无显著性。A、B两组第4周时Brdu/vWF双染阳性细胞均较第1周有显著增加(P<0.05)。6.3在A、B两组随着Brdu/Nse阳性细胞表达增加,移植前与移植后第4周NSS的差值增加,呈直线相关。表明随着Brdu/Nse阳性细胞增多神经功能改善增加。6.4第1周、第4周时A、B两组中Nestin阳性细胞明显高于Brdu/Nestin双染阳性细胞(P<0.001)。7移植后4周梗死体积占半球百分比分别为A组11.15%、B组9.00%、C组22.46%、D组23.86%、E组19.86%,P=0.001,组间比较有显著性差异。A=B>C=E>D。结论1外源性HSCs在大鼠脑梗死灶周围能够存活、并可分化为神经干细胞、神经元细胞。2外源性HSCs在大鼠脑梗死灶周围可以分化为内皮细胞。使脑内VEGF表达加强,促进缺血组织血管新生。3外源性HSCs移植能明显改善局灶性脑缺血大鼠神经功能,缩小梗死体积。4 NGF对外源性移植的HSCs在脑内存活、分化有促进作用。5 NGF可诱导内源性神经干细胞增殖,促进受损神经功能的改善。6 rhG-CSF诱导内源性HSCs移植能改善局灶性脑缺血大鼠神经功能,缩小梗死体积。但治疗效果不如外源性HSCs移植显著。