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第一部分自噬在京尼平苷保护心肌缺血再灌注损伤中的作用及机制研究目的:探讨京尼平苷(Geniposide,GP)对体内心肌缺血再灌注(Ischemia/reperfusion,I/R)损伤和体外缺氧复氧(Hypoxia/reoxygenation,H/R)损伤的影响及其机制。方法:体内部分SD大鼠行缺血30 min,再灌注2 h,建立心肌I/R损伤模型。实验分为假手术(Sham)组、I/R组和I/R+GP组。采用TTC染色评估I/R后大鼠心肌梗死面积,HE染色评估心肌组织结构,超声心动图评估心脏功能,TUNEL染色检测心肌组织细胞凋亡百分比,IHC染色检测心肌组织中Beclin1蛋白表达,TEM观察自噬体形成,Western Blot检测Bax、Bcl-2、ATG5、ATG7、Beclin1、LC3-I/II、P62、AKT和p-AKT蛋白表达。体外部分H9c2细胞行缺氧12 h、复氧4 h,建立H/R损伤模型。实验分为七组:对照(Control)组、Control+GP组、Control+雷帕霉素(Rapamycin,RAPA)组、H/R组、H/R+GP组、H/R+RAPA组和H/R+GP+RAPA组。采用CCK-8检测细胞存活率,流式细胞仪检测细胞凋亡百分比,TEM观察自噬体的形成,Western Blot检测ATG5、Beclin1、LC3-I/II、P62、Bax、Bcl-2、AKT、p-AKT、mTOR和p-mTOR蛋白表达。结果:体内部分(1)TTC染色:Sham组无明显心肌梗死,I/R+GP组心肌梗死面积较I/R组缩小。(2)HE染色:与Sham组比较,I/R组心肌组织结构紊乱、细胞肿胀和细胞核皱缩,而I/R+GP组心肌组织急性损伤较I/R组明显减轻。(3)心脏超声:I/R组的EF、FS值较Sham组降低,而GP预处理提高了I/R损伤后的EF、FS值。I/R组的SV、IVSs值较Sham组降低,而GP预处理增加了I/R损伤后SV、IVSs值。(4)TUNEL染色:I/R组心肌组织TUNEL染色阳性核(棕黄色)明显高于Sham组,而GP预处理显著降低了I/R损伤诱导的细胞凋亡百分比。(5)IHC染色:GP预处理降低了心肌组织I/R损伤诱导的Beclin1表达。(6)TEM检测:GP预处理抑制了I/R损伤后心肌组织自噬体的累积。(7)Western Blot:I/R组Bax蛋白表达较Sham组增加,而I/R+GP组Bax蛋白表达减少。I/R干预后Bcl-2蛋白表达及Bcl-2/Bax比值降低,并被GP预处理所逆转。与I/R组比较,GP预处理减少了ATG5、ATG7、Beclin1蛋白表达并降低LC3-II/LC3-I比值,增加了p62蛋白表达。另外,GP预处理也增加了I/R损伤后p-AKT蛋白表达。体外部分(1)CCK-8检测:GP预处理增强了H/R损伤后H9c2细胞活力,而GP保护H/R损伤的作用被RAPA共孵育所抵消。(2)流式细胞仪检测:Control组、Control+GP组和Control+RAPA组的细胞凋亡率无显著差异,RAPA预处理可以阻断GP抑制H/R诱导的细胞凋亡。(3)TEM检测:H/R诱导自噬体积累,H/R+GP组自噬体数量较H/R组减少,而在H/R条件下,RAPA预处理抵消了GP抑制自噬体形成的作用。(4)WesternBlot:在H/R条件下,GP预处理减少了ATG5、Beclin1、LC3-II/I蛋白表达及p62蛋白降解,而GP的此作用被RAPA抵消。同时,与H/R组相比,GP预处理抑制了Bax蛋白表达,并增加Bcl-2蛋白表达和Bcl-2/Bax的比值,而GP的这种作用被RAPA预处理所抵消。另外,GP预处理上调了H9c2细胞在H/R期间p-AKT和p-mTOR蛋白表达。与H/R+GP组相比,H/R+GP+RAPA组p-mTOR表达降低,p-AKT表达升高。各组间总AKT和mTOR表达无显著差异。结论:GP可以通过抑制过度自噬保护心肌I/R损伤,这可能涉及激活AKT/mTOR信号通路。第二部分京尼平对缺氧复氧损伤后心肌细胞凋亡及自噬的影响目的:研究京尼平(Genipin,GE)对缺氧复氧(Hypoxia/reoxygenation,H/R)损伤后心肌细胞凋亡及自噬的影响。方法:H9c2细胞行缺氧12 h、复氧4 h,构建H/R损伤模型。实验分为Control组、GE组、H/R组和H/R+GE组。采用CCK-8检测细胞存活率,流式细胞仪检测细胞凋亡百分比,TEM观察自噬体形成,Western Blot检测Bax、Bcl-2、P62、Beclin1、LC3-I/II、AKT、p-AKT、m TOR和p-m TOR蛋白表达。结果:(1)CCK-8检测:H/R损伤后H/R、1、5、10、20、40和80μM GE组的细胞存活率均较Control组明显降低,但10、20和40μM GE组的细胞存活率较H/R组明显增强,其中以20μM组最强。(2)流式细胞仪检测:GE预处理可以降低H/R损伤后细胞凋亡百分比。(3)TEM检测:GE预处理可以减少H/R损伤后自噬体的数量。(4)Western Blot:GE预处理减少了H/R损伤后Bax、LC3-II和Beclin1蛋白表达,并增加Bcl-2、P62、p-AKT和p-m TOR蛋白表达。结论:GE可以减少H/R损伤后心肌细胞凋亡及自噬,这可能涉及激活AKT/m TOR信号通路。