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L-异亮氨酸是八种必需氨基酸之一,在人体代谢中具有重要作用。在L-异亮氨酸的合成过程中,乙酰羟基酸合成酶催化丙酮酸和前体α-酮基丁酸生成L-异亮氨酸。由于乙酰羟基酸合成酶对α-酮基丁酸亲和性高于丙酮酸,当胞内α-酮基丁酸供应量增加时,乙酰羟基酸合成酶可优先催化生成L-异亮氨酸。同时乙酰羟基酸合成酶是L-异亮氨酸合成途径的限速酶,强化该酶可以加速限速反应,有利于L-异亮氨酸积累。为了研究增加胞内α-酮基丁酸的供应和强化乙酰羟基酸合成酶对L-异亮氨酸发酵的影响,本文以L-异亮氨酸生产菌C. glutamicum YILW为出发菌株进行改造,通过质粒过表达cimA成功构建了C. glutamicum YILWpXMJ19cimA;在出发菌株基因组ilvB上游插入Ptac强启动子成功构建C. glutamicum YILWPtac;在C. glutamicum YILWPtac基础上质粒过表达cimA,获得C. glutamicum YILWPtacpXMJ19cimA。通过RT-PCR分析,cimA和ilvB的转录量分别提高了920.0倍和12.5倍。SDS-PAGE分析cimA在C. glutamicum YILWpXMJ 19cimA可以表达。对出发菌株和改造菌进行摇瓶补料分批发酵比较改造菌产酸水平的变化。结果发现,与出发菌C. glutamicum YILW相比,YILWpXMJ19cimA和YILWPtac的L-异亮氨酸积累量提高了8.9%和14.8%,糖酸转化率提高了17.8%和18.6%,单位菌体产酸提高了15.1%和20.3%,副产物L-丙氨酸较原菌分别降低了25.0%和29.9%。Cglutamicum YILWPtacpXMJ19cimA的L-异亮氨酸积累量较原菌提高了14.5%,副产物L-丙氨酸较原菌降低了8.6%,糖酸转化率和单位菌体产酸分别提高了42.4%和17.6%,糖酸转化率较YILWpXMJ 19cimA和YILWPtac分别提高了20.8%和20.0%。实验结果表明通过Ptac强启动子插入协同cimA表达增加胞内α-酮丁酸的供应和强化限速酶乙酰羟基酸合成酶的方法可以提高产酸,并能够较明显的提高菌体的糖酸转化率。代谢分析表明L-异亮氨酸合成代谢流从1.09%分别提高到2.33%、7.69%和4.26%。5L发酵罐发酵实验出现菌体在20 h过早地进入稳定期,并表现出生长停滞,耗糖耗氧变慢的情况。针对该现象在发酵过程中依次流加了豆饼水解液、玉米浆、生物素、氨基酸复合液、嘌呤核苷、酵母粉及微量元素等多种营养物质。结果菌体生物量低的问题依然没有解决。通过流加实验排除了流加的成分是菌体生长的限制因素,猜测可能是玉米浆中的某种或某几种未知的营养因子限制菌体生长和产酸。