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目的:癌症是威胁人类健康的主要疾病,根据2020年世界卫生组织国际癌症研究机构发布的186个国家,36种癌症的发病率和死亡率的统计数据显示,2020年中国新发癌症人数与癌症死亡人数分别占据着全球第一的位置,且随着人口老龄化在全球范围内的不断加剧,预计到2040年癌症负担将增加50%,全球预计癌症患者将达到3000万。结直肠癌（Colorectal Cancer,CRC）是消化道最常见的恶性肿瘤之一,因其起病隐匿,病因目前并不完全清楚。CRC早期治疗以手术切除为主,但因其原发癌位置位于盆腔最内侧,解剖关系较为复杂。中晚期确诊时由于癌灶转移,已无法进行手术切除,只能使用化疗药物进行治疗,但目前应用于临床病人的绝大多数化疗药物都是非靶向性的,在杀伤肿瘤细胞的同时也会影响正常细胞的功能,且存在严重的耐药现象,因此寻找一种可长期使用的特异性化疗药物对于结直肠癌的治疗有着重要的意义。转录因子红细胞系衍生核因子-2相关因子1（Nuclear factor erythroid-derived 2-related factor 1,NFE2L1）属于CNC-b ZIP转录因子亚家族,广泛表达于包括肠道在内的多种组织器官,是一种短寿命蛋白。生理状态下,由mRNA转录翻译后的NFE2L1蛋白分子通过其N端的跨膜结构域锚定在内质网膜上,当未收到转录激活信号时,被N-聚糖酶去糖基化修饰后翻转进入细胞质中,在内质网中通过泛素蛋白酶体系统（Ubiquitin-proteasome system,UPS）进行完全降解,即保持细胞浆内的低水平。当受到氧化应激刺激时,NFE2L1的转录活性被激活,此时蛋白酶体系统不再将其完全降解,而是由DNA损伤诱导型1同源物2（DNA damage inducible 1homolog 2,DDI2）穿梭因子引导进行剪切修饰其N端的内质网跨膜域,形成具有转录活性的长亚型片段进入细胞核中,通过与小Maf蛋白形成异二聚体,最终结合到靶基因启动子或增强子区域的抗氧化反应元件（Antioxidant response element,ARE）上,启动下游基因的表达,主要涉及抗氧化反应、蛋白酶体稳态、氧化应激、线粒体呼吸、炎症反应以及细胞增殖与分化等一系列基因。针对结直肠癌细胞具有无限增殖的特点,与正常细胞相比,需要合成更多的生物大分子,因此其细胞内部的生物运转压力更大,其中蛋白质是维持机体运转不可或缺的生物大分子之一。UPS是降解未折叠蛋白的一种重要机制,是真核细胞中最主要的蛋白质质量控制系统,目前被认为是治疗恶性肿瘤的一种新型靶点。其原理是利用癌症细胞相对敏感的特点,通过给予癌症患者蛋白酶体抑制剂（Proteasome Inhibitors,PIs）的方式,抑制蛋白质降解速率,加剧癌细胞内的生物运转压力,最终导致细胞内蛋白毒性的发生从而诱导细胞的死亡,进而达到化疗的效果。其中硼替佐米（Bortezomib,BTZ）是2003年由FDA批准的首个PIs,也是目前治疗血液肿瘤的一线药物。因此本研究采用慢病毒转染的方式得到不同亚型NFE2L1稳定沉默及空白对照细胞系,通过体外实验进行不同时间点及不同剂量的BTZ暴露,探究其如何影响蛋白酶体系统的功能从而对结直肠癌细胞系造成损伤以及NFE2L1在其中发挥的作用。研究方法:1.构建对照（Scramble）和NFE2L1全亚型（NFE2L1（A））和长亚型（NFE2L1（L））稳定沉默的结直肠癌细胞系:以293T细胞作为病毒载体,利用商品化的人NFE2L1shRNA质粒进行包装,随后使用具有一定病毒滴度的慢病毒转染人结直肠腺癌细胞系（Caco-2）,在培养箱中经48 hr转染后,更换含1.6μg/ml嘌呤霉素的培养液进行筛选,直至传代后的细胞无大量漂浮时,进行蛋白水平和mRNA水平的验证。2.通过急性BTZ暴露判断其对蛋白酶体系统的抑制效果:给予不同细胞系急性BTZ暴露0～24 hr,通过提取蛋白和mRNA进行NFE2L1的定量检测。当UPS功能被抑制时,作为待降解底物,NFE2L1的蛋白降解速率被抑制,因此其蛋白水平会出现累积;同时当UPS功能被抑制时,NFE2L1会被诱导激活启动蛋白酶体亚基的表达,因此其mRNA水平也会在一定范围内代偿性升高。通过NFE2L1的相对水平可以间接反映出BTZ对Caco-2细胞系蛋白酶体的抑制效果。3.通过急性BTZ暴露判断不同细胞系对该种细胞毒性的敏感性是否存在差异以及通过何种机制实现:给予不同浓度的BTZ急性暴露0～24 hr,通过CCK8和台盼蓝染色实验判断Scramble及NFE2L1（A）-KD和NFE2L1（L）-KD细胞系间细胞存活率是否存在差异;通过上述实验筛选出Scramble与NFE2L1（A）-KD细胞系之间存在细胞存活率的差异,随后对细胞凋亡和坏死的部分蛋白分子进行WB检测,夯实结果。在机制解析部分,通过急性BTZ暴露后对部分蛋白酶体亚基的mRNA水平以及细胞内质网应激的相关分子进行检测,初步判断不同细胞系细胞存活率之间差异形成的原因以及NFE2L1在其中发挥的作用。结果:1.通过慢病毒转染的方式成功建立Scramble及NFE2L1（A）-KD和NFE2L1（L）-KD细胞系,通过mRNA和蛋白水平验证。2.BTZ急性处理显著增加Caco-2细胞中NFE2L1积累,并呈现剂量-效应关系,表明BTZ对结直肠癌细胞内蛋白酶体系统具有抑制作用。3.NFE2L1（A）-KD细胞系对BTZ的急性细胞毒性更为敏感,但NFE2L1（L）-KD细胞与Scramble细胞相比并无显著差异。4.BTZ暴露可诱导Caco-2细胞出现以凋亡形式为主的细胞死亡,NFE2L1（A）-KD细胞凋亡增多。5.BTZ暴露可导致Caco-2细胞发生蛋白酶体反弹效应以及应激反应,NFE2L1（A）-KD细胞中蛋白酶体的反弹效应减弱,细胞内应激反应加重。结论:NFE2L1缺失后并不影响Caco-2细胞的存活与增殖,但给予BTZ处理后NFE2L1（A）-KD细胞细胞毒性更为强烈,表明NFE2L1在调控直肠癌细胞对于蛋白酶体抑制所致细胞毒性中发挥重要的作用。通过对部分蛋白酶体亚基的mRNA水平以及细胞内内质网应激水平检测,发现NFE2L1（A）缺失会抑制蛋白酶体的反弹机制并诱导更加剧烈的细胞内氧化应激及细胞凋亡。综上所述,NFE2L1是调控结直肠癌细胞蛋白酶体稳态以及对抗BTZ诱导的细胞毒性的关键因子,提示NFE2L1是影响以BTZ为代表的蛋白酶体抑制剂类抗癌药物对结直肠癌化疗效果的关键因子之一。