背景视网膜色素变性（Retinitis pigmentosa,RP）是一种常见的遗传性致盲眼病。群体患病率在不同的种族人群中较为相似,约1/3500-4000。在该病中,患者的视网膜感光细胞和色素上皮细胞变性导致夜盲和进行性视野缺损。RP有多种遗传方式,大多数为单基因遗传,包括常染色体显性遗传RP、常染色体隐性遗传RP、X染色体连锁遗传RP（X-linked retinitis pigmentosa, XLRP）及线粒体连锁遗传RP。其中XLRP约占所有RP患者的6-20%,患者发病年龄早、损害最为严重、预后甚差,是青少年致盲的常见原因之一,目前已在X染色体上定位了6个与XLRP相关的基因位点,分别是:RP2、RP3、RP6、RP23、RP24和最近新定位的RP34。其中已被先后成功克隆的有两个基因:RP2和RP3。家系连锁分析表明约10%-20%的XLRP与位点RP2连锁,约70%-80%的XLRP与位点RP3连锁。这表明RP2基因和RP3基因是XLRP的主要致病基因。RP3基因又名RPGR基因,它在不同的组织细胞中有不同的选择性剪接产物,其中在视网膜细胞中以RPGRORF15转录子为主。该转录子包括原来确定的RPGR的19个外显子的前14个外显子和外显子ORF15（原外显子15和部分内含子15的区域）。近年来在英国、北美、德国及日本等地人群的研究表明,外显子ORF15是XLRP的一个突变热点区,约60%-80%的XLRP患者在该外显子内都存在致病突变。同时在这个长达1706bp的序列中,包含了一段至少1000bp的AG高度重复的嘌呤区,使得对该区域的测序无论是在引物设计上还是在延伸过程中都变得异常困难。目前有关XLRP的分子遗传学研究仍主要集中在白种人群,亚洲人群的报道则主要来自于日本,而有关中国人XLRP相关基因突变的系统研究还未见报道,只有一些零散家系的个案报道,且突变筛选的范围很少涉及到外显子ORF15的难测区域。目的通过连锁分析和单倍型分析的方法对一例新收集到的XLRP家系进行致病基因定位分析,进一步确定家系的X性连锁遗传模式,初步判定该家系的女性携带者,为该家系的女性亲属及其子女提供该病的基因诊断和遗传咨询。对在课题组前期工作中经基因定位基本判定为RP2型或RP3型XLRP的家系及新收集到的疑似XLRP的10例散发患者进行RP2基因和RP3基因的突变的筛选和检测,以寻找相关致病突变和SNP多态性位点。通过基因突变的分析研究,了解我国XLRP患者的基因突变状况,并提供更多的有关基因型和表型相关联的数据。方法本课题组前期工作应用微卫星多态性位点通过连锁分析和单倍型分析对4例中国疑似XLRP家系的致病基因进行了定位分析并确定其中有3个家系为RP2或RP3型XLRP家系。本次研究主要分两部分阐述:第一部分首先阐述我们应用微卫星多态性位点对新收集到的1例中国疑似XLRP家系进行基因定位分析,确定其致病基因位点。第二部分阐述我们结合课题组前期成果,对基因定位基本判定为RP2型或RP3型XLRP的共计3个家系及10例疑似XLRP散发患者进行侯选基因RP2和RPGR的突变筛选,尤其针对既是突变热点区又是测序困难区的外显子ORF15进行相关的序列测定和基因突变分析研究。在第一部分基因定位分析中,我们应用微卫星多态性位点（根据RP2、RP3、RP6、RP23和RP24位点的连锁定位信息,其中重点针对RP2和RP3共选取位点附近的12个微卫星多态标记）用多点参数分析方法计算其最大优势对数值（LOD score）,对新收集到的1例疑为X连锁型视网膜色素变性家系进行遗传连锁分析和单倍型分析。在第二部分的基因突变分析中,我们主要针对定位后的侯选基因RP2基因和RPGR基因在视网膜中主要的选择性剪接产物RPGRORF15,尤其针对突变热点区外显子ORF15进行相关的序列测定和基因突变分析研究。首先对全体男性患者的RP2基因和RPGR基因进行序列测定,经比对后寻找突变位点,再针对其突变位点对其家系成员进行该区域的序列测定以进一步确定突变与疾病共分离,并作出相关的家系突变分析。结果第一部分的基因定位分析结果:确定了ZSC家系致病基因的大致范围:RP23或RP6基因,同时验证了该家系的X性连锁遗传模式。第二部分的基因突变分析结果:在对基因定位于RP2或RP3基因位点的3个XLRP家系和10例疑似XLRP的散发患者进行RP2基因和RPGR基因的测序比对分析后发现,在RP2基因未发现有基因突变;在RPGR基因的1-14号外显子及部分外显子的侧翼内含子区域中发现了6个已有报道的SNP多态性位点;在外显子ORF15发现了两个致病突变g.ORF15+483₄84delGA和g.ORF15+821₈22delGG（前者已有报道,后者至今未见相关报道）、5个已有报道的多态性位点、5个至今未见报道的单碱基替换（g.ORF15+899 A>T、g.ORF15+899 A>G、g.ORF15+988 A>G、g.ORF15+1072 A>G、g.ORF15+1511 G>A）和1个未见报道的21个碱基的重复（g.ORF15+1149₁169 dup 21）。两个致病突变g.ORF15+483₄84delGA和g.ORF15+821₈22delGG分别发现于ZLK家系和XY家系,且与疾病呈现共分离。结论本次研究应用微卫星多态性位点对新收集到的一例疑似XLRP家系进行了基因定位分析。主要结合连锁分析和单倍型分析将其致病基因定位于RP23或RP6,进一步确定了该家系的X性连锁遗传模式,初步判定该家系的女性携带者,从而为该家系的女性亲属及其子女提供了该病的基因诊断和遗传咨询。对课题组前期工作中已确定为RP2型或RP3型的3例XLRP家系全部患者以及疑似XLRP的10个散发患者进行了RP2和RPGR基因的序列测定以寻找相关致病突变和探索SNP多态性位点。我们找到了两个家系的致病突变,其中一个致病突变为首次报道;另外还发现了17个多态性位点,其中有6个为首次报道,丰富了人类XLRP疾病的突变谱。此外,从突变发生区域来看,两个致病突变和17个多态性位点中的11个均存在于外显子ORF15,这就很好地表明:外显子ORF15不仅在英国、北美、德国及日本等地是RPGR基因中的一个突变热点区,在我们所研究的中国人群中也是一个突变热点区。针对所发现的突变,我们对其进行了相关的功能预测和氨基酸编码改变的推测,推测致病突变引起氨基酸移码突变后提前终止编码,生成一段缺失进化保守功能域的截短蛋白。怀疑截短蛋白的生成与疾病的发生有密切的关系。对RPGR基因及其功能有了更深一步的认识。通过本次研究,我们还建立了对突变热点区同时也是测序困难区的外显子ORF15的一整套测序的策略和方法,为后续的该疾病的分子遗传学研究奠定了良好的基础。