背景肝移植是治疗终末期肝病最有效的方法,同时移植后的急性排斥反应威胁受体和移植物的长期存活。近年来随着肝移植手术量的逐年增多,大样本量的数据分析发现急性排斥反应显著地增加了移植物衰竭和受体死亡的风险。因此,在目前供肝来源短缺的情况下,肝移植术后应尽量避免急性排斥反应的发生来延长受体的存活时间。充分了解急性排斥反应发生的机制和识别关键免疫分子是治疗急性排斥反应的基石,有助于弥补目前免疫抑制剂在选择性和特异性方面的不足。枯否氏细胞(Kupffercell,KC)是肝脏定植的巨噬细胞,在肝移植免疫调节过程中发挥双重作用。一方面,KC不仅能够通过表达Fas配体诱导T细胞凋亡,而且能够分泌抑炎因子(IL-10,TGF-β)促进Th2细胞极化从而诱导免疫耐受。另一方面,KC作为抗原提呈细胞表达MHCII类分子和CD40促进T细胞活化,分泌促炎因子(IL-6,IL-23,IL-iβ)诱导Th17细胞分化,从而加重排斥反应。KC有两种极化状态,M1型和M2型。M1型主要分泌促炎因子而M2型主要分泌抑炎因子。因此,KC在肝移植中的作用主要与它的极化状态有关。纤维蛋白原样蛋白2(Fibrinogen-like Protein 2,FGL2)是纤维蛋白超家族中的一员。FGL2有两种蛋白形式:一种是膜相关性FGL2,具有促进凝血酶原活化的作用;另外一种是可溶性FGL2(soluble Fibrinogen-like Protein 2,sFGL2),主要由 CD4+CD25+FoXp3+调节性 T细胞(Treg)分泌并发挥抑制免疫反应的作用。sFGL2作为新出现的免疫抑制分子逐渐受到关注,其不仅通过受体FcγRIIB抑制T细胞的增殖和树突状细胞的成熟,而且诱导调节性B细胞的活化,在肾脏、心脏移植中发挥诱导免疫耐受的作用。但是,sFGL2对巨噬细胞尤其是KC的作用还不清楚,其在肝移植急性排斥反应中的作用仍未充分研究。目的1.阐明在大鼠原位肝移植中sFGL2的表达特征,M2型KC的比例以及两者之间的关系。2.探讨sFGL2对KC极化的作用和机制。3.揭示sFGL2在大鼠肝移植急性排斥反应中的作用和调节机制。方法1.大鼠原位肝移植中sFGL2的表达特征,M2型KC的比例以及两者之间的关系1)建立大鼠原位肝移植急性排斥反应和耐受模型,RT-PCR检测移植物中FGL2的表达,ELISA检测血清中sFGL2的表达。2)流式细胞术检测肝移植急性排斥反应和耐受模型中M2型KC的比例。3)应用Pearson相关分析观察肝移植急性排斥反应和耐受模型中sFGL2与M2型KC比例之间的关系。2.sFGL2对KC极化的作用和机制1)提取原代KC进行培养和鉴定。2)体外应用大鼠FGL2重组蛋白联合LPS/IFN-γ共刺激KCs,RT-PCR和ELISA分别检测KC和培养基中IL-10、TGF-β、IL-12和TNF-a的表达水平。流式细胞术检测F4/80+CD206+KC的比例。3)Western-Blot检测 STATl、p-STATl、NF-KBp65、p-p65、IκBa和p-IKBa蛋白表达量。3.sFGL2在肝移植急性排斥反应中的作用和调节机制1)利用腺相关病毒载体构建大鼠体内过表达FGL2模型,RT-PCR检测肝脏组织FGL2的表达,ELISA检测血清中sFGL2的表达。2)构建大鼠原位肝移植急性排斥反应模型,大鼠肝移植受体过表达FGL2的急性排斥反应模型。观察受体大鼠肝移植术后生存时间;提取肝脏移植物进行HE染色;根据Banff标准进行RAI评分;检测大鼠肝功能指标AST、ALT、TBIL。提取移植物中的KC细胞,RT-PCR检测 IL-10、IL-12、TGF-β、TNF-a和 Arg-1 的表达水平,Western-Blot检测Arg-1蛋白表达量。3)在大鼠原位肝移植急性排斥反应模型构建过程中,采用经门静脉过继回输KCs的方法观察术后受体大鼠生存时间,提取肝脏移植物进行HE染色;根据Banff标准进行RAI评分;检测大鼠肝功能指标AST、ALT、TBIL。结果1.与对照组和急性排斥反应组相比,大鼠原位肝移植耐受组中FGL2表达增高,血清中sFGL2浓度增高;M2型KC在大鼠原位肝移植耐受组中比例升高。Pearson相关分析提示FGL2的表达和sFGL2的含量与M2型KC的比例呈正相关性。2.sFGL2促进KC分泌IL-10和TGF-β,抑制KC分泌IL-12和TNF-a;sFGL2 促进 KC 表达 CD206 分子;sFGL2 抑制 KC 内 STAT1和NF-κB信号通路。3.腺相关病毒载体转染大鼠后过表达sFGL2;与急性排斥反应组和空载病毒转染组相比,sFGL2病毒转染组生存时间延长;HE染色提示淋巴细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞浸润减少;RAI评分降低;肝功能指标AST、ALT和TBIL降低;sFGL2病毒转染组提取的KC促进IL-10、TGF-β和Arg-1表达,抑制IL-12和TNF-a表达。4.与急性排斥反应组相比,过继转移来源于sFGL2病毒转染组的KC延长大鼠生存时间;HE染色提示过继转移来源于sFGL2病毒转染组的KC减轻大鼠原位肝移植急性排斥反应;过继转移来源于sFGL2病毒转染组的KC能够改善大鼠的肝功能。结论1.sFGL2体外促进KC向M2型极化,可能与抑制KC内STAT1和NF-κB信号通路有关。2.过表达sFGL2抑制大鼠原位肝移植急性排斥反应,同时诱导KC向M2型极化。3.sFGL2通过诱导M2型KC极化从而缓解大鼠原位肝移植急性排斥反应。