论文部分内容阅读
目的建立大鼠肝缺血再灌注损伤模型,按时点采集标本,对血清尿素氮(BUN),血清肌酐(Cr),肾组织脂质过氧化物的终产物-丙二醛(MDA)及血清中肿瘤坏死因子(TNF-a)进行测定；对肾组织进行MMP-2、MMP-9蛋白测定,探讨氯化钆抑制枯否细胞对大鼠肝缺血再灌注所致肾损伤的保护作用及其机制。材料与方法1、材料选择周龄为7～8周雄性Wistar大鼠100只,体重为180～220g,按体重随机分为实验组(氯化钆+肝缺血再灌注)和对照组(生理盐水+肝缺血再灌注)。氯化钆购自日本和光纯药工业株式会社；血生化相关试剂购自德国宝灵曼公司；TNF-a试剂盒(美国BD公司)；丙二醛(MDA)测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)；兔抗大鼠MMP-9抗体(美国Santa Cruz公司)；兔抗大鼠MMP-2抗体(美国Santa Cruz公司)。HITACHI-7600A全自动生化分析仪；芬兰Multlskan MK-3型全自动多功能型酶标仪；图片分析采用MetaMorph/Evolution MP5.0/BX51显微图象分析系统。2、方法实验组术前24h、48h经鼠尾静脉注射氯化钆(1Omg/kg),对照组给予等量生理盐水。参照Kobayashi法建立左半肝缺血再灌注模型(阻断左肝动脉、门静脉及肝管),缺血均为60分钟,按再灌注后0.5h, 1h、6h、12h、24h时点采集标本,每组每个时点10只大鼠。麻醉药选择10%水合氯醛,按3ml/kg计量腹腔注射给药。免疫组化标本固定均采用4%多聚甲醛0.1mol/L磷酸缓冲液(pH=7.3)。经膈肌心脏穿刺取血后,离心5min,留取上清液,血清由超低温冰箱保存,集中测定。采用酶联免疫吸附法测定血清中TNF-a的水平。取大鼠左肾,其中左肾中1／3肾组织均浆后TBA法测定MDA；取左肾下1／3肾组织2×1x0.3cm行免疫组化染色。免疫组化结果在400倍光镜下观察,胞浆内出现棕黄色为阳性细胞。每张切片取5个不重叠的高倍视野,测量IOD值,求出其均值,代表本张切片的平均IOD值。IOD为累计积分光密度。所有计量指标均用mean士SD表示。所有数据均用专业软件SPSS13.0进行统计,采用t检验。结果1、血清BUN再灌注后1h开始,实验组血清BUN低于对照组,且6、12及24h时点实验组与对照组相比有显著性差异(P<0.05)。2、血清Cr再灌注后,各时点实验组血清Cr均低于对照组,实验组在再灌注后6、12及24h时点与对照组相比有显著性差异(P<0.05)。3、血清TNF-α再灌注后,实验组各时点的血清TNF-α均低于对照组,有显著差异(P<0.05)。且两组走势基本相同,12h达到高峰,之后有下降趋势。4、肾组织匀浆MDA再灌注后6h、12h、24h时点实验组MDA明显低于对照组(P<0.05)。5、肾组织MMP-2染色再灌注后,两组染色的IOD值均随时间延长呈上升趋势,12h后上升趋势变缓。实验组再灌注后各时点IOD值均低于对照组,且6、12及24h时点实验组和对照组之间存在显著性差异(P<0.05)。阳性表达部位主要在皮质深层近曲小管上皮细胞、肾小管周围的血管内皮细胞及间质细胞。6、肾组织MMP-9染色再灌注后,两组IOD值随时间呈递增走势,实验组较对照组增长速度缓慢,各时点IOD值均低于对照组,且6、12及24h时点实验组和对照组之间存在显著性差异(P<0.05)。阳性表达部位与MMP-2阳性表达部位相近,主要在皮质深层近曲小管上皮细胞、肾小管周围的血管内皮细胞及间质细胞。结论本研究通过建立大鼠肝缺血再灌注损伤模型,按再灌注后不同时点分别采集标本,测定血清BUN、血清Cr、血清TNF-α、肾组织MDA以及对肾组织行MMP-2、MMP-9免疫组化染色,探讨氯化钆抑制枯否细胞对大鼠肝缺血再灌注所致肾损伤的影响,得出以下结论：①在肝缺血再灌注过程中,枯否细胞被激活并释放的大量生物活性物质,随体循环到达肾时,造成的肾损伤；②生物活性物质,如TNF-α、氧自由基等可对肾脏造成直接伤害外,还可以通过上调肾组织中MMP-2、MMP-9的表达,加重肾脏的损伤；③抑制枯否细胞的激活,减少氧自由基的释放及血液中TNF-α的浓度,避免肾组织中MMP-2、MMP-9的表达上调,从而减轻肾脏的损伤。