目的：本研究通过细胞实验证实西妥昔单抗耐药细胞分泌的外泌体诱导敏感细胞发生耐药的机制，对外泌体通过携带miRNA靶向PTEN调控PI3K/AKT信号通路的作用机制进行了深入的探究，同时，通过差异性基因表达筛选出西妥昔单抗敏感性的预测因子。研究结果为明确西妥昔单抗的继发性耐药提供了理论依据。　　方法:1.利用MTT法检测细胞增殖能力。2.利用ExoQuickTC试剂提取西妥昔单抗耐药细胞来源的外泌体。3.利用JEM-1200EX电镜验证外泌体形态特征。4.利用免疫荧光技术验证外泌体与靶细胞结合。5.脂质体介导miRNA及siRNA转染。6.利用Western blotting检测CD63，Calreticulin，EGFR，p-EGFR，Akt，p-Akt，PTEN，GAPDH蛋白的表达。7.利用RealTime-PCR验证mRNA与miRNA的表达。8.利用TCGA数据集中包含临床病理学参数的数据，采用3.2.3版本R语言进行差异性表达分析。　　结果:在RKO细胞中，Akt磷酸化水平高于Caco-2细胞;在RKO分泌的外泌体中，Akt磷酸化水平同样高于Caco-2细胞，但PTEN表达低于Caco-2细胞，提示PTEN/Akt通路可能参与到外泌体诱导的耐药机制中。利用C225分别作用Caco-2与RKO细胞24小时、48小时后，免疫印迹方法检测p-EGFR，EGFR，PTEN，p-Akt，Akt，GAPDH蛋白表达，结果显示，C225在24小时以及48小时能够抑制Caco-2细胞p-EGFR，p-Akt水平，且作用48小时的抑制效果更加明显，相比之下，PTEN的表达水平并无明显变化，证实C225是通过阻断EGFR及AKT信号通路发挥抑制细胞增殖的作用。在RKO细胞中，C225尽管能够抑制p-EGFR的表达，但p-Akt表达并未收到抑制，提示Akt参与到RKO细胞的耐药机制中。利用不同浓度RKO细胞分泌的外泌体(20，50μg/ml)处理Caco-2细胞48小时后，发现经外泌体处理后的细胞，PTEN表达水平下调，同时p-Akt表达水平上调，且蛋白表达变化存在浓度依赖性。上述结果提示，西妥昔单抗耐药细胞来源的外泌体，可能通过抑制敏感细胞PTEN表达，同时促进p-Akt上调，诱导敏感细胞发生耐药。4.RKO分泌的外泌体通过PTEN/Akt信号通路，促进Caco-2细胞发生耐药。利用RKO细胞来源的外泌体(50μg/ml)预处理Caco-2细胞48小时后，洗去，再利用C225(10μg/ml)处理Caco-2细胞48小时，结果发现，外泌体诱导的p-Akt活化作用并未受到C225的抑制，证实外泌体通过抑制PTEN表达同时上调p-Akt促进敏感细胞耐药。为进一步证实Akt在诱导耐药中的作用，利用Akt抑制剂LY294002联合C225处理经外泌体预处理后的Caco-2细胞48小时后，MTT实验检测C225对Caco-2细胞的抑制率，结果提示LY294002能够逆转外泌体诱导的Caco-2细胞耐药;免疫印迹方法证实LY294002通过再次抑制被外泌体激活的p-Akt，恢复Caco-2细胞C225的敏感性。上述结果证实，RKO分泌的外泌体通过PTEN/Akt信号通路促进Caco-2细胞发生耐药。5.RKO分泌的外泌体通过传递miRNA-21抑制PTEN表达，促进Caco-2细胞耐药。利用RT-PCR方法检测经RKO分泌的外泌体(50μg/ml)处理Caco-2细胞48小时后PTEN mRNA水平，结果显示Caco-2细胞PTEN mRNA未发生明显变化，P＞0.05。提示PTEN的蛋白表达水平下调存在转录后调控机制。利用美国GENECENSOR公司的miRNA芯片发现，RKO分泌的外泌体中包含有大量的miRNAs，提示外泌体可能是通过miRNA调节PTEN的蛋白表达。根据在线生物信息分析工具miRWALK2.0及芯片数据筛选出在RKO细胞与Caco-2细胞差异性表达的靶向PTEN的miRNAs。利用RealTime-PCR方法验证miR-21-5p作为调节PTEN的miRNA在RKO细胞中表达高于Caco-2细胞，P＜0.0001。为进一步验证外泌体携带miR-21至Caco-2细胞内，利用RKO分泌的外泌体(50μg/ml)处理Caco-2细胞48小时后，RT-PCR验证外泌体处理组的Caco-2细胞miR-21表达量相比对照组上调1.577±0.1295倍，P＜0.05。通过过表达Caco-2细胞miR-21，C225(10μg/ml)对于Caco-2细胞的抑制作用明显减弱，同时能够抑制PTEN表达激活下游Akt通路。上述结果说明，RKO分泌的外泌体通过将携带的miR-21-5p传递至Caco-2细胞内，并抑制PTEN的表达，激活Akt信号通路，促进敏感细胞发生耐药。6.KRT5在右半结肠肿瘤高表达并与西妥昔单抗耐药相关，结肠癌来源的外泌体中包含KRT5。利用TCGA数据集进行左右半结肠癌差异表达分析。利用Bioconductor/TCGAbiolinks函数包从TCGA数据库(https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/)下载并预处理结肠癌数据集表达谱数据，利用EdgeR函数包进行左右半结肠癌差异性表达分析，根据富集结果，筛选p＜0.05，LogFoldChange＞2的前5位基因，分别为KRT14、SPRR3、SPRR2E、KRT5与SPRRB。从NCBI的GEO数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）下载基因表达谱结肠癌样本数据集GSE56386的series matrix数据。利用在线分析工具GEO2R(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/)进行西妥昔单抗敏感组与耐药组差异性表达分析。基因差异性表达结果根据P＜0.05剔除差异不明显的基因，按照LogFoldChange值进行排序，发现KRT5为排名首位的差异性表达基因，同时利用GSE72120数据集验证KRT5差异表达情况。利用西妥昔单抗敏感细胞系Caco-2与耐药细胞系RKO、HT29验证KRT5差异性表达，通过敲除RKO细胞KRT5基因后，MTT实验证实西妥昔单抗对RKO细胞抑制作用增强，结果提示KRT5高表达与西妥昔单抗耐药相关。利用ExoCarta（http://exocarta.org/＃）外泌体数据库证实，结肠癌细胞来源的外泌体中包含KRT5。细胞实验证实，RKO细胞来源的外泌体中KRT5表达高于Caco-2细胞来源的外泌体，提示耐药细胞可通过外泌体携带KRT5诱导敏感细胞发生耐药。7.KRT5高表达样本与细胞黏附、黏着斑、趋化因子、细胞因子相互作用信号通路相关。相关性分析证实KRT5的表达与肿瘤部位有关。为进一步探究KRT通过何种方式参与西妥昔单抗的耐药，利用STRING蛋白质数据库进行蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)分析，结果发现，KRT5与EGFR和ERBB2(HER2)存在关系。利用GSEA对TCGA数据库中KRT5高表达组基因进行富集分析，结果提示KRT5高表达样本富集到细胞黏附(P=0.012，FDR=0.152)、黏着斑(P=0.019，FDR=0.069)、趋化因子(P=0.008，FDR=0.093)、细胞因子相互作用(P=0.01，FDR=0.057)等相关基因集。在TCGA数据集中共纳入246例临床参数完整的病例资判，其中男120例，女126例，年龄30～84岁。结果显示，KRT5的表达与肿瘤部位有关(P=0.005);而与年龄(P=0.096)、TNM分期(P=0.552)、性别(P=0.800)无关。同时，对西妥昔单抗耐药相关突变KRAS、BRAF、PIK3CA与KRT5高表达进行相关性分析发现，KRT5高表达与BRAF突变相关(P=0.015)，而与KRAS(P=0.812)、PIK3CA(P=0.374)无关。　　结论:1.西妥昔单抗耐药细胞RKO分泌的外泌体，能够促进敏感细胞Caco-2发生耐药。2.RKO细胞分泌的外泌体，通过抑制PTEN，激活Akt通路，逆转Caco-2细胞西妥昔单抗的敏感性。3.RKO细胞分泌的外泌体，通过携带miR-21-5p，负向调节Caco-2细胞PTEN表达，促进西妥昔单抗耐药。4.KRT5在右半结肠高表达且与西妥昔单抗耐药相关，结肠癌来源的外泌体中包含KRT5。5.KRT5高表达样本与细胞黏附、黏着斑、趋化因子、细胞因子相互作用信号通路相关。相关性分析证实KRT5的表达与肿瘤部位及BRAF突变有关。