柑橘为芸香科柑橘亚科柑橘属(Citrus)果树,原产于亚洲、大洋洲的热带和亚热带地区,主要分布在亚洲、北美洲、拉丁美洲、地中海沿岸等地区,是世界主栽果树之一(Bartholomew and Sinclair 1952;Sinclair 1961;Scora 1975;Ramana et al.1981;Gmitter and Hu 1990)。其主要栽培类型包括甜橙(C.sinensis(L.)Osbeck)、宽皮柑橘(C.reticulata(L.))、葡萄柚(C.paradisi Macfad)、柠檬(C.limon(L.)Burm.)和株檬(C.aurantifolia Swingle)四大类。根据世界粮农组织2012年的数据统计显示,巴西、中国、美国、西班牙和墨西哥是目前柑橘主产国(FAO 2012)。从世界柑橘消费情况看,分为鲜食和加工类型,其中,鲜食类以甜橙为主,而柑橘加工产品则主要是橙汁。根据美国农业部最新数据统计显示,世界对柑橘产品的需求仍在持续增长。中国甜橙鲜果产量达到760万吨,橙汁产量达到6万吨,仅次于巴西,但是仍然主要供应国内市场。柑橘果实对人类健康有着重要的价值,主要提供能量和必须的营养元素,比如碳水化合物、维生素C和纤维素等。此外,柑橘果实中还含有一些重要的植物化合物,如类胡萝卜素、黄酮类化合物以及柠檬苦素等。研究发现,这些植物化合物具有抗癌作用(Chug-Ahuja et al.1993;Holden et al.1999;Nagy 1980,Sharoni etal.2012)。随着工业技术的发展,柑橘精油的提炼也成为一个新兴的产业。与此同时,柑橘加工过程中还能形成其它高附加值的副产品,如柑橘皮可用于制作动物饲料、柑橘酱、柑橘果冻等。柑橘除了具有这些营养价值和加工价值外,它还可以用于生产塑料,也是一种绿色环保的天然能源植物。研究发现,柑橘是类胡萝卜素积累最丰富的果实,已有超过1 15种的类胡萝卜素在柑橘中鉴定出来(Matsumotoet al.2007)。而目前在植物中已鉴定出的类胡萝卜素超过 700 种(Kat0 2012;Melendez-Martinez et al.2005)。类胡萝卜素是一种具有若干共轭双键的萜类化合物,它们本身是具有从黄色到红色的天然色素(Bramley 1997)。类胡萝卜素对植物的发育具有重要的生理功能,是果实成色的天然植物色素,可采集不同于叶绿素所含波段的光源,以及消化过剩的光,从而起到光保护的作用(Goodwin 1980)。此外,类胡萝卜素还具有抗氧化的作用,其中具有β环的类胡萝卜素(如β-类胡萝卜素、β-隐黄质等)是合成维生素A的前体,对人类和动物的健康具有重要意义(Gross 1987;Cunningham and Gantt 1998;von Lintig 2010;Sanchez-Moreno et al.2003;Ye et al.2000),尤其是 β-隐黄质具有抗氧化和心脑血管疾病的潜在功能(Olson 1989;Nishino et al.2009)。有研究表明,增加葡萄柚的食用量可降低肺癌的发病率(Feskanich2000)。目前,有关柑橘类胡萝卜素合成代谢相关基因的克隆与表达,及其代谢机制的研究分析有较多报道。比如利用不同柑橘种类或品种大量开展了类胡萝卜素合成代谢基因的表达与功能分析(Ikoma et al.2001;Kim et al.2001a,b;Kita et al.2001;Tao et al.2005;Tao et al.2007;Kim et al.2010)。对类胡萝卜素合成代谢基因研究发现,上游的八羟基番茄红素合成酶(CitPSY)、八羟基番茄红素脱饱和酶(CitPDS)、ζ-胡萝卜素脱饱和酶(CitZDS)和番茄红素环化酶(CitLCYB),与下游的β-胡萝卜素羟化酶(CitCHYB)和玉米黄质环氧化酶(CitZEP)的表达水平比率对β-隐黄质(β-cryptoxanthin)和紫黄质(violaxanthin)积累比例有着决定性的作用,而果皮中的类胡萝卜素含量高于果肉,这与果皮中相关基因表达量增加有关(Fanciullino et al.2008;Kato et al.2004;Rodrigo et al.2004)。柑橘果肉颜色突变体是研究柑橘类胡萝卜素合成代谢途径的优良材料,因此被广泛用于开展类胡萝卜素合成及代谢相关研究。例如,红肉脐橙Cara Cara与亲本脐橙相比,积累了大量的番茄红素(lycopene)、八羟基番茄红素(phytoene)、六羟基番茄红素(phytofluene)和β-胡萝卜素(β-carotene),研究发现其突变与类胡萝卜素合成代谢的上游MEP代谢途径上基因表达水平的增加有关(Alquezar et al.2008)。而对另一个红肉变种红暗柳“Hong Anliu”(C.sinensis)分析发现,其番茄红素(lycopene)的大量积累是由类胡萝卜素合成代谢途径中基因的上调表达引起的(Liu et al.2007)。Alquezar等(2009)发现甜橙和葡萄柚中都含有LCYB2a和LCYB2b两个番茄红素环化酶基因,其中LCYB2b编码蛋白在番茄红素β-环化过程中不具有功能。在红肉葡萄柚中主要积累LCYB2b从而导致了番茄红素的大量积累。上述研究阐明,不同柑橘变种中类胡萝卜素合成代谢途径的机制不同,而且类胡萝卜素的合成并不总与相关基因的转录水平一致。有色体作为类胡萝卜素合成代谢的主要场所,对不同果实中有色体的大量研究揭示了有色体蛋白组学上的独特性。相关研究表明,有色体中95%的蛋白是由细胞内核酸编码并转运到有色体中的,仅有100个左右的蛋白是在有色体中编码(Heazlewood et al.2007;van Wijk and Baginsky 2011)。目前有关柑橘有色体代谢机制的研究主要集中在植物生理方向,有关蛋白组学的研究极少(Zeng et al.2011)。综上所述,虽然前人已对柑橘类胡萝卜素合成代谢途径相关基因和调节机制进行了大量的研究,但仅凭现有已知基因的转录表达水平分析并不完全能解释类胡萝卜素的积累机制(Fanciullino et al.2008;Cao et al.2010)。表明在柑橘类胡萝卜素合成代谢途径中还存在着一些未知的基因或基因家族成员,并且这些基因或基因家族成员可能形成新的类胡萝卜素代谢通路或积累机制。Chen等人(2010)通过生物信息学分析从柑橘基因组数据库中挖掘出了 19个新的类胡萝卜素合成代谢途径基因家族成员。因此,本文在此基础上,对这些新发掘的类胡萝卜素合成代谢途径基因家族成员的时空表达特点和表达模式,以及它们与类胡萝卜素积累的关系展开研究,并进一步对类胡萝卜素合成代谢组织有色体进行蛋白组学研究,旨在为进一步挖掘与类胡萝卜素积累相关的未知调控基因和调控机制提供实验依据。本文主要研究结果如下:1.类胡萝卜素合成代谢途径基因家族成员在伏令夏橙果实成熟期不同组织中的表达特点研究利用实时荧光定量(real time RT-PCR)和高效液相色谱法(HPLC)分别对类胡萝卜素合成代谢途径的新基因家族成员表达水平和类胡萝卜素积累进行了研究。从2011年12月到次年2月,每个月采集15个伏令夏橙的果实用于实验。果实直径用游标卡尺测定,用Minolta CR-330色度计测定果皮和果肉的颜色。每个果实果皮颜色为位于果实赤道部位3次测量数据的平均值,以Hunter参数的a/b比率表示,果汁颜色分别用Hunter参数的L*,a*和b*表示。L值从0到100,代表从黑色到白色;a值从负到正,代表从绿色到红色;b值从负到正,代表从蓝色到黄色。果实可溶性固形物(SSC)由折射仪测定,酸度(TA)用无水柠檬酸滴定pH值为8.2的NaOH测定,成熟度用SSC/TA的比值表示。在2011年11月份分别采集15张完全成熟叶片和幼嫩叶片。果皮、果肉和叶片各组织的15个样品被分为三组作为生物学重复,且每个生物学重复进行两次技术重复。由于柑橘果汁中的糖含量较高,严重影响了高质量RNA的提取。本文在前人研究的基础上,新建了一套高效的柑橘果汁RNA TRIzol提取方法,该方法使用样品量少,获得RNA质量高。在基因表达水平研究中,本文采用相对定量法,用GAPDH作为内参基因。类胡萝卜素的提取参照Lee和Castle(2001)的方法并进行了改良。结果表明,(1)八羟基番茄红素合成酶基因PSY-Contig 22在果皮、果肉和叶片中均有表达,而PSY-Contig10仅在叶片中特异表达,说明这两个家族成员具有组织表达特异性。这两个基因在果肉中的表达水平显著低于在果皮中的表达水平,这与在拟南芥中观察到番茄红素合成酶为非光合组织中类胡萝卜素合成的限制性酶的结果一致。(2)本文对柑橘中ae-胡萝卜素脱饱和酶基因(ZDS)1 1个家族成员的基因表达特点进行了研究,未发现这些基因家族成员在柑橘类胡萝卜素合成过程中具有相关功能。(3)番茄红素环化酶基因LCYB-Contig21在叶片中的表达量最高,在果肉中的表达量最低,这与前人研究发现的番茄红素环化酶基因LCYB1倾向于在绿色组织中表达的结果类似。(4)辣椒红素合成酶基因CCS-Contig19和CCS-Contig16在果实和果皮中均有表达,但CCS-Contig16在叶片中也有表达,而CCS-Contig19在叶片中未检测到表达。序列比对发现,CCS-Contig19和CCS-Contig16可能分别对应是番茄红素环化酶LCYB2a和LCYB2b,其中LCYB2b编码的蛋白并不参与调控番茄红素转化为a-隐黄质的代谢途径。(5)柑橘中4个a-胡萝卜素羟化酶基因CHYB在果皮和果肉中均有表达,且该基因表达量增加的同时,伴随着β,β-叶黄素(β,β-xanthophyll)含量的增加,因此认为这4个胡萝卜素羟化酶为BCH类型,即倾向于羟化具有β环的β-胡萝卜素。(6)在果实成熟期,紫黄质(violaxanthin)为果皮和果肉中主要的类胡萝卜素类型,但其积累模式不同。果皮中的紫黄质在12月份开始大量积累,而果肉中的紫黄质含量在次年1月份开始大量积累。同时检测到PSY-Contig22、ZDS-Contig23、CHYB-Contig25和CHYB-Contig07几个基因家族成员在果皮中的表达量一直持续增加,而果肉中先是在12月降低,然后在次年1月再次增高。据此认为,这些基因的大量表达与β,β-叶黄素的积累具有明显相关性。(7)叶片中大量的叶黄素(lutein)积累伴随着番茄红素环化酶LCYB-Contig21的高表达和β-胡萝卜素羟化酶CHYB家族成员的低表达。综上所述,本研究首次对15个新的类胡萝卜素合成代谢途径基因家族成员在甜橙果皮、果肉和叶片中表达特点进行了研究,并结合各组织中类胡萝卜素含量变化进行了相关性分析,在与前人研究结果比较的基础上,揭示了各基因家族成员表达时空特异性。2.类胡萝卜素合成代谢途径基因家族成员在伏令夏橙及其深色果肉突变体于果实发育期的表达模式研究该部分对前述基因在伏令夏橙及其突变体“Rohde Red”伏令夏橙的果皮和果肉中的表达特点进行了分析研究。材料采集从2012年7月开始,每隔一个月取材一次,直到次年3月为止。试验方法与第一部分相同。数据分析采用了 JMP软件(http://www.jmp.com)。结果表明,(1)在果实绿色期,伏令夏橙和“Rohde Red”伏令夏橙果皮中类胡萝卜素含量较低,这与类胡萝卜素合成代谢基因家族成员的基因表达水平较低相一致。虽然所有类胡萝卜素合成代谢基因家族成员的表达水平在“Rohde Red”果皮中比普通伏令夏橙高(如图3-4所示),但两者间总的类胡萝卜素积累量无显著差异(图3-2,表3-5)。(2)虽然类胡萝卜素合成代谢途径上游的基因成员(八羟基番茄红素合成酶基因、八羟基番茄红素脱饱和酶和ζ-胡萝卜素脱饱和酶基因)的表达量较高,但ε-番茄红素环化酶基因LCYE-Contig03和LCYE-Contig24表达量较低,从而导致两个栽培品种果肉中类胡萝卜素含量较低。这表明ε-番茄红素环化酶(LCYE)可能是伏令夏橙果肉早期类胡萝卜素积累的限制性酶。(3)在9月至11月,叶黄素(lutein)在“Rohde Red”果皮中的含量急剧下降(图3-3,表3-6),我们认为“Rohde Red”中类胡萝卜素合成代谢途径从α,β-叶黄素(α,β-xanthophyll)转向β,β-叶黄素(β,β-xanthophyll)的合成早于普通伏令夏橙。(4)在11月份,“Rohde Red”果皮中与β,β-叶黄素合成代谢相关的基因大量表达,但其类胡萝卜素的积累总量与普通伏令夏橙无显著差异,说明“Rohde Red”中基因的大量表达并未导致类胡萝卜素的大量积累。这可能与类胡萝卜素合成代谢途径的上游MEP代谢途径上的某个或几个基因的表达相关(Alos et al.2006;Fanciullino et al.2008)。(5)在β,β-叶黄素(β,β-xanthophyll)大量积累的时期,虽然两个品种中八羟基番茄红素基因PSY的表达量相似,但八羟基番茄红素脱饱和酶基因PDS-Contigl7、ζ-胡萝卜素脱饱和酶基因ZDS和辣椒红素合成酶/番茄红素环化酶基因CCS-Contigl9在“Rohde Red”中表达量更高(图3-6),这伴随着β-隐黄质(β-cryptoxanthin)的积累(图3-5,表3-7),我们推测其可能的原因在于“Rohde Red”中有更高的β-类胡萝卜素合成。(6)两个品种果肉中β-类胡萝卜素的含量非常低;“Rohde Red”中 β-隐黄质(β-cryptoxanthin)和紫黄质(violaxanthin)的比例为1.64,而温州蜜柑中两者的比例为5.17。其可能的原因主要有两个,一是胡萝卜素羟化酶基因CHYB在“Rohde Red”果肉中大量表达,促进β-隐黄质(β-cryptoxanthin)向玉米黄质(violaxanthin)代谢。二是玉米黄质环氧化酶基因ZEP的大量表达,促进玉米黄质向紫黄质转化。因此,β-隐黄质(β-cryptoxanthin)在“Rohde Red”中的大量积累与八羟基番茄红素脱饱和酶基因PDS-Contigl7、ζ-胡萝卜素脱饱和酶基因ZDS和辣椒红素合成酶/番茄红素环化酶基因CCS-Contigl9的大量表达相关。综上所述,该部分研究着重探讨了类胡萝卜素合成代谢途径基因家族成员的表达与两个不同果色的伏令夏橙栽培品种中类胡萝卜素积累的相关性,尤其对“Rohde Red”伏令夏橙中大量积累的β-隐黄质(β-cryptoxanthin)可能的机制进行了探讨,为进一步开展类胡萝卜素合成代谢途径相关基因转录后翻译和MEP代谢途径基因的深入研究奠定了基础。3.伏令夏橙和“Rohde Red”伏令夏橙有色体的蛋白组学研究2013年12月,采集伏令夏橙和“Rohde Red”的果肉,根据不同的实验目的进行相应处理,并提取有色体进行蛋白组学分析。分别利用实时荧光定量、高效液相色谱法和气相色谱法(GC-MS)分析测定23个类胡萝卜素合成代谢基因家族成员的表达水平,以及各样品中类胡萝卜素和芳香物质含量。有色体的提取参照前人的研究方法(Zenget al.2011),并作了适当改良。蛋白的鉴定通过LC-MS/MS分析,原始数据通过利用 Mascot(Matrix Science,London,UK;version 2.4)和 NCBI绿色植物数据库(ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)进行比对。为了检测具有细胞活性的蛋白所在的组织,先把所有鉴定出的蛋白与拟南芥数据库(TAIR 10)进行比对,选取其中具有最低E-value的拟南芥AT序列,进一步与SUBA数据库(http://suba.plantenergy.uwa.edu.au)进行比对。根据比对结果,在SUBA的两个数据库中被预测为质粒蛋白的就暂时认定为有色体蛋白。再将预测为有色体蛋白的序列进行 Blast2Go 和 Mapman(http://mapman.gabipd.org/web/guest/mapman)功能归类分析。结果表明,(1)在普通伏令夏橙和“Rohde Red”有色体中分别鉴定出238和199个蛋白,两个品种共鉴定出306个蛋白(表4-4和4-5),而Zeng等人(2011)从柑橘有色体中鉴定出了 400多个蛋白。这中差异可能与有色体的发育阶段,不同的样品和所取样品的生长环境相关。(2)根据Blast2Go和Mapman的功能归类分析,在12月份两个栽培品种的有色体中,有大量蛋白参与了碳水化合物的合成代谢、抗胁迫和氧化还原、蛋白调控和转运以及氨基酸的合成代谢等途径。在“Rohde Red”有色体中,参与能量代谢和合成代谢前体的蛋白多于普通伏令夏橙有色体中的相应的蛋白数量。相反,在普通伏令夏橙有色体中,检测到更多的蛋白参与了光合代谢、蛋白调控和抗胁迫,表明两个栽培品种有色体中存在不同的抗胁迫和蛋白调控机制。(3)在两个栽培品种有色体中没有检测到类胡萝卜素合成代谢途径上的任何基因,但检测到若干类胡萝卜素合成代谢上游和下游途径上的基因,推测12月份可能不是类胡萝卜素代谢的高峰,这与两个品种的晚熟性相关。值得一提的是,在普通伏令夏橙有色体中检测到了类胡萝卜素裂解酶双加氧酶(CCD1),该酶在细胞质中发挥功能,所以被归入污染蛋白类(表4-6)。该酶裂解类胡萝卜素形成芳香化合物,但普通伏令夏橙的芳香化合物积累量显著低于“Rohde Red”伏令夏橙。我们据此推测,“Rohde Red”伏令夏橙中有大量类胡萝卜素裂解酶双加氧酶的表达,但在提取样品时被清除。综上所述,本文从基因组、转录组、代谢组和蛋白组水平上对伏令夏橙和“Rohde Red”伏令夏橙两个甜橙栽培品种果实颜色改变机制进行了研究,揭示了15个类胡萝卜素合成代谢途径新基因家族成员的时空表达特点及其与类胡萝卜素含量变化的关系,对进一步挖掘柑橘类胡萝卜素合成代谢相关的基因与调节因子,探索类胡萝卜素合成代谢调节机制奠定了重要基础,具有重要的参考价值。