背景:有丝分裂是细胞生命活动的重要特征之一,从十九世纪末发现至今一直受到科学家的高度重视和关注,经过漫长的探索和研究,科学家们发现细胞有丝分裂是受时间和空间上的复杂、精巧的调控过程。细胞有丝分裂异常会导致非整倍体(aueuploidy)细胞的增加,与肿瘤的发生和发展具有密切的联系。　　经漫长的进化过程,细胞具备了能保证细胞周期DNA复制和染色体分配顺利完成的检查机制,被称为细胞周期检查点(cell cycle checkpoints)。细胞周期检查点的调控机制是保证细胞周期事件按次序、正常发生的细胞周期调控机制,也是细胞周期调控的关键因素。细胞周期检查点的调控主要通过一系列酶来完成的,根据文献报道,参与细胞有丝分裂重要的调控酶类主要有:Plk1, Cdk1等细胞周期依赖性蛋白激酶(cyclin-dependent kinases,CDKs),PP1,Cdc14等细胞周期的磷酸酶,纺锤体组装检查点(spindle assembly checkpoint,SAC)和E3泛素连接酶后期促进复合体等相关分子。　　Plk1(Polo-like kinase1)是细胞周期有丝分裂重要的丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶,在细胞有丝分裂进程中发挥极其重要的作用,在细胞周期不同亚期Plk1定位不同。到目前为止,已经揭示有几十个Plk1的底物,Plk1通过与这些底物相互作用来影响细胞周期有丝分裂的进入、纺锤体的形成、姐妹染色单体间的分离、中心体的复制以及胞质分裂的过程;另外,Plk1本身的亚细胞定位也受相应底物的调控。在人类肿瘤的发生发展过程中,最主要的表现为细胞增殖异常和迁移能力的增加,激酶 Plk1是调控细胞有丝分裂的关键分子,经大量的研究证实在肿瘤细胞中Plk1具有明显的高表达;在体外细胞培养和动物实验中,低表达Plk1能够有效地抑制肿瘤细胞的增殖并促进其自身凋亡,但对正常细胞没有明显的影响。因此,在人类肿瘤的治疗中,Plk1激酶的靶向治疗很可能成为的潜在新方法。　　Erbin(ErbB2 Interacting protein)定位于细胞膜和相邻细胞连接处,最早在2000年以癌基因ErbB2为诱饵通过酵母双杂交实验时被发现,并因此而命名。我们实验室早期自主制备了Erbin抗体,在检测Erbin抗体做免疫荧光时发现,Erbin具有细胞周期依赖性表达升高和有丝分裂亚细胞动态定位的特征,这些研究结果提示Erbin在细胞周期中对细胞有丝分裂可能具有重要的调控作用。我们也发现Erbin具有有丝分裂依赖的磷酸化修饰特征,其磷酸化发生与Plk1的激活时程(time pattern)相似,且在细胞周期有丝分裂中存在明显的亚细胞共定位(中心体和中体),由此提示Erbin可能是Plk1新的底物蛋白;因此,本课题拟通过分析Plk1与Erbin的相互作用,探讨Erbin作为Plk1新的底物蛋白对细胞有丝分裂的调控作用及机制。　　目的:在细胞水平上研究Erbin是否具有细胞周期依赖性的表达及其磷酸化,在细胞有丝分裂周期中Erbin亚细胞定位的变化,揭示Plk1对Erbin磷酸化的影响及其在细胞有丝分裂中亚细胞共定位,Erbin与Plk1相互作用的结构域。初步探索Erbin对细胞有丝分裂的影响。　　方法:通过细胞周期同步化实验进一步观察Erbin细胞周期依赖性的表达及其磷酸化特征,研究Erbin与Plk1在细胞有丝分裂中磷酸化的关系。利用免疫荧光(IF)检测细胞周期中Erbin亚细胞定位的动态变化特征,检测Erbin与Plk1在细胞周期有丝分裂中的共定位作用,检测内源和外源Erbin与Plk1相互作用的定位基础,检测Erbin不同截断体的定位从而确定Erbin的核定位基础。利用分子生物学技术构建相应的载体,经免疫共沉淀(Co-IP)实验初步证实内源和外源Erbin与Plk1存在相互作用,利用Erbin和Plk1的不同结构域的截断体进一步证实Erbin与Plk1相互作用的结构域,并且经过GST-Pull down实验进一步佐证Erbin与Plk1的相互作用及其二者相互作用的结构域。经过序列比对分析实验,推测并证实Cdk1是Plk1磷酸化Erbin的点火激酶。利用Erbin siRNA干涉实验证明Erbin敲低对Plk1磷酸化的影响;利用流式细胞术,经Nocodazole同步化(M)释放实验,PI染色检测Erbin siRNA干涉后对细胞周期的影响;经DAPI和Golgin-97染色细胞核和高尔基体,检测Erbin敲低对细胞有丝分裂细胞核的影响;在正常人乳腺细胞MCF-10A中敲低Erbin表达,在倒置显微镜下有丝分裂细胞数的变化。　　结果:首先我们利用抗微管药物Nocodazole处理细胞使细胞阻滞于G2/M期,分析G2/M期细胞裂解样品中Erbin蛋白在电泳中的泳动,结果观察到其迁移明显变缓,而在λ磷酸酶处理可以翻转Nocodazole引起的Erbin条带迁移变缓现象,证实磷酸化修饰是引起Erbin在G2/M期条带上移的原因,进一步用双胸腺嘧啶使细胞阻滞于G1/S期,然后释放,观察细胞在自然进入M期时 Erbin条带泳动的变化,结果发现Erbin在从G2进入M期(T9-T11)时条带明显上移,并与激酶Plk1的活化pattern一致;而敲低Plk1可抑制Nocodazole引起的Erbin条带上移,表达激活型Plk1和野生型Plk1可直接导致外源表达的Erbin条带上移(转染失活型的Plk1无此作用),以上实验结果证实M期Erbin磷酸化依赖于激酶Plk1。此外我们亦初步证实Cdk1是Plk1磷酸化Erbin的点火激酶。进一步我们利用免疫荧光观察细胞周期中的Erbin具有明显的中体和中心体定位,在有丝分裂前、中期Erbin与Plk1在中心体具有明显的共定位,在末期和胞质分裂期两者在中体有明显的共定位。免疫共沉淀实验证实Erbin-PDZ结构域与Plk1的催化区(Plk1-CD)相互作用,而Erbin-Inter区只与活化的Plk1发生相互作用。并GST-Pull down实验亦进一步佐证Erbin与Plk1的相互作用,即Erbin-PDZ不与Plk1-PBD结合,而与Plk1-CD结合,而Plk1-PBD与磷酸化的Erbin-Inter区有更强的体外作用。这些相互作用实验结果提示,Erbin是Plk1新的底物,Erbin被磷酸化的底物区域存在于Erbin-Inter区,而Erbin-PDZ可能调控Plk1的活性。我们亦进一步证实了过表达PDZ对Plk1磷酸化的抑制作用和延缓有丝分裂进入。我们也观察到慢病毒感染敲低Erbin15天后,细胞明显分裂异常,主要表现为多核细胞显著增强。　　结论:本研究证明了Erbin具有细胞周期依赖性的表达及细胞周期有丝分裂的亚细胞定位动态特征,并且具有有丝分裂依赖的磷酸化修饰现象,与Plk1激酶存在明显的相互作用,并且初步验证Cdk1是Plk1磷酸化Erbin中的“点火”(priming)激酶,Plk1磷酸化Erbin的底物结合区存在于Erbin-Inter区,而Erbin-PDZ结构域通过与Plk1-CD结构域结合,可能空间位阻上干扰Plk1 T210的激活。以上结果提示,Erbin即作为Plk1的底物又可负调控Plk1活性,Erbin是一个重要的新的有丝分裂调控分子。Erbin敲低明显促进了细胞的增殖以及多核细胞的产生,Erbin失调介导细胞周期异常可能与肿瘤的发生发展密切相关。进一步揭示Erbin-PDZ介导的负调控Plk1的分子机制,可能为探索新的Plk1抑制分子药物提供极有价值的信息。