充血性心力衰竭（congestive heart failure, CHF）是由于心功能减退引起的一种临床综合征，是各种心血管疾病的严重阶段，也是一个严重的社会健康问题。因此，对充血性心力衰竭的研究一直受到科研工作者的重视。CHF是一种需要长期治疗的疾病，然而目前在临床治疗中仍面临许多问题。药物长期应用难免产生一些副作用，长期使用药物也会给患者造成巨大的经济负担。目前用于治疗心衰药物的半衰期一般不超过24小时，在接受治疗的患者当中，仅有27%能长期坚持按照医嘱服用药物，即药物依从性差。因此，寻找更为合理、有效的药物、治疗方法、方案和策略，仍然是研究工作者关注的问题。肾上腺髓质素（adrenomedullin, ADM）是Kitamura等人于1993年从手术切除的人肾上腺嗜铬细胞瘤 (phaeochromocytoma , PC)组织提取物中发现的一种生物活性肽。在体内，它广泛分布于全身各系统中，具有舒张阻力血管，降低血压，改善心脏收缩功能，利尿利钠，增加肾脏血流灌注的作用。ADM被认为是在临床治疗高血压、慢性心功能衰竭等多种心血管疾病中具有巨大潜在应用价值的一种内源性多肽，因此ADM基因也成为基因治疗慢性心功能不全的重要候选基因。同时，也由于肾上腺髓质素的临床应用受其半衰期短（仅22min）的限制，随着分子生物学技术的发展，探索体内表达ADM的方法，成为发挥ADM治疗作用的一条有价值的途径。本课题分六部分。1．构建重组ADM真核表达载体，并在无内源性ADM表达的K562细胞株上进行了体外表达实验。实验中采用RT-PCR技术从大鼠肾上腺组织分离得到的RNA中扩增ADM cDNA片段，并将扩增的cDNA片段插入pcDNA3.1真核表达质粒，构建成含ADM cDNA的重组质粒pcDNA3.1ADM。用脂质体介导将该质粒转染体外培养的哺乳动物K562细胞。在转染的细胞中，用RT-PCR检测证实有ADM mRNA存在；在经转染细胞的培养液上清中，用斑点免疫分析方法证实有ADM多肽存在。以上结果证明本实验中构建的重组pcDNA3.1ADM载体能够在哺乳类细胞中表达ADM。2．实验中用pcDNA3. 1ADM处理体外培养的心肌细胞并用BCA方法检测总蛋白含量，结果显示，10-7mol/L的ANGⅡ处理心肌细胞72 hr能诱导心肌细胞总蛋白含量增加，而在开始用ANGⅡ处理细胞时即转染pcDNA3.1ADM的一组72 hr后ANGⅡ诱导的心肌细胞蛋白合成增多得到部分抑制。3．实验中用结扎大鼠冠状动脉前降支的方法构建了慢性心功能减退的实验动物模型，并采用心动超声和导管法评价心脏功能。我们设立5个实验组，第一<WP=6>组是假手术组，第二组、第三组、第四组、和第五组是冠状动脉结扎5周后的动物，随机分成4组。实验结果显示，结扎冠状动脉5周后，大鼠的心功能较假手术组有显著减退，表现为中心静脉压、左室舒张末压增高，(dp/dtmax、平均动脉压和射血分数降低，同时伴心率增快。第二组动物经尾静脉注射30 μg pcDNA3.1，第三组动物尾静脉注射30 μg pcDNA3.1ADM。在每只动物注射30 μg pcDNA3.1ADM处理后，第三组动物的心功能参数中，中心静脉压（CVP）有降低趋势，但与第二组相比未见显著性变化；其它心功能参数与第二组比较均未见显著性差异。随后我们将pcDNA3.1ADM的剂量增加至100 μg。而注射100 μg pcDNA3.1ADM的大鼠与第四组相比，中心静脉压、左室舒张末压降低，-dp/dtmax、射血分数增加；而+dp/dtmax、心输出量、平均动脉压及心率没有显著差别。 在肾脏功能方面，结扎冠状动脉5周后，大鼠尿量和尿钠排出量减少。30 μg pcDNA3.1ADM处理后，第三组动物的尿量和尿钠排出量与第二组相比未见显著性变化；100 μg pcDNA3.1ADM处理组大鼠的尿钠排量与第四组比较没有显著差异，但24小时尿量增加。以上本实验结果表明，在心功能减退的大鼠中，静脉给予100 μg pcDNA3.1ADM后，可以在不降低平均动脉压的情况下产生利尿作用，心脏的前负荷降低，伴有中心静脉压、左室舒张末压降低，射血分数增加。4．实验中用PCR方法检测静脉注射pcDNA3.1ADM后其在大鼠体内的分布。结果在心、肺、肾、脑、肝、脾等脏器中扩增到pcDNA3.1的部分特异序列。进一步用原位杂交的方法进行检测。由于肾上腺髓质素是一种内源性多肽，因此用PCR方法制备了针对pcDNA3.1载体的探针，探针用地高辛标记，以NBT/BCIP作为显色底物。用探针与给予pcDNA3.1ADM的大鼠的组织切片进行杂交，结果在肺脏、肾脏见到有较强的杂交信号。上述结果表明，进入体内的pcDNA3.1ADM在多个脏器有广泛分布，尤其在肺脏、肾脏等血管较丰富的组织中有较多的分布。5．用放射免疫分析方法检测大鼠血浆中ADM 的含量，结扎冠状动脉5周后的大鼠，血浆ADM含量较假手术组血浆ADM含量有显著增高； 100 μg pcDNA3.1ADM干预组大鼠血浆ADM含量较第二组的更高，但尚无统计学显著性差异。放射免疫测定结果也显示，心功能减退大鼠心、肺组织中ADM的含量明显增高；用 100 μg pcDNA3.1ADM干预的大鼠的肺脏中ADM的浓度，较给予pcDNA3.1空载体组的高；而干预后心脏中ADM的含量则较给予pcDNA3.1空载体组的低。对于上述结果，我们认为在心功能减退的动物中，血浆和组织ADM的升高是机体的一种代偿反应；在这种情况下再给予外源性的pcDNA3.1ADM，血浆和组织