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武昌罗索线虫(Romanomermis wuchangensis)是一种昆虫病原索科线虫,可主动侵染多种库蚊和伊蚊的幼虫(孑孓),寄生率即等于害虫的死亡率,生物防治潜力极大。在武昌罗索线虫整个生活史中,营养均来源于其寄生期吸取宿主血淋巴微环境中的营养物质,它的另一个特点是性别分化为营养决定型,即每一宿主体内寄生的线虫越少,每条线虫在宿主体内血淋巴中吸取的营养越多,越有可能发育为雌虫,反之则为雄虫。为探究昆虫病原索科线虫营养决定性别分化的分子机理,本课题组前期通过转录组测序并以秀丽线虫(Caenorhabtditis elegans)为背景筛选出fox-1、tra-2、laf1、fem-1、tra-1、mab-3、mab-7、mab-5、gld-1、egl-4 等10个与性别分化和性腺发育相关的基因,并对其中的fox-1、tra-2、laf1、fem-1、tra-1、mab-3、mab-7等基因的功能进行了初步研究,但对mab-5、gld-1、egl-4基因在武昌罗索线虫性别分化过程中的作用仍认识不足。本文通过观察武昌罗索线虫寄生期的生长状况及停止喂食孑孓以探讨其营养决定性别分化的关键期,利用qRT-PCR和RNAi等技术探索了 mab-5、gld-1、egl-4基因在该线虫性别分化中的作用,其主要结果如下:1.本文比较了埃及伊蚊和致倦库蚊不同宿主对武昌罗索线虫雌、雄性比的影响,结果显示:宿主的种类并不影响寄生后期线虫的雌雄性比,当感染比例为1:1时(孑孓:线虫),线虫全部发育为雌虫,感染比例大于或等于1:10,线虫全部发育为雄虫。当线虫的感染强度为1时,全部发育为雌虫;感染强度大于或等于4,全部发育为雄虫;随着线虫感染强度的增加,线虫的个体逐渐变小。对武昌罗索线虫寄生期生长发育的观察发现,无论是雌虫还是雄虫,在整个寄生期(1-7天),线虫的体宽逐天增加,而线虫的体长在寄生期1-2天没有显著性变化,直到寄生期的第3天才开始出现极显著性变化(p<0.001)。说明线虫进入宿主体内的第三天才开始快速发育,到寄生期的第4-5天线虫体长加倍增长,雄虫第6天、雌虫第7天增长变缓。另外,本研究还从线虫寄生的第3天起禁止喂食于宿主,宿主禁食1天后,与对照组相比,实验组在感染强度为1时,雌线虫的比例由100%下降了80.0±4.2%,感染强度为2、3时雌线虫的比例分别由40.0%±2.2%、22.2± 1.3%降为0,即全部发育为雄性。宿主禁喂2天或3天后,感染强度为1的线虫也全部发育成雄性。随着禁止喂食宿主时间的延长,线虫个体也逐渐变小。2.qRT-PCR结果显示:mab-5基因在雌、雄线虫寄生期第4天(p<0.01)、第5天(p<0.01)以及寄生后期第1天(p<0.01)、第3天(p<0.01)、第5天(p<0.001)的表达量均出现显著性或极显著性差异;gld-1基因在雌、雄线虫寄生期第4天(p<0.001)、寄生后期第5天(p<0.01)的表达量出现极显著性或显著性差异;egl-4基因在雌、雄线虫寄生期第5天(p<0.001)、成虫期(p<0.01)的表达量出现极显著或显著性差异;以上3个基因均在雌虫的寄生期高表达。3.RNAi结果表明:干扰mab-5、gld-1、egl-4基因后并不会引起武昌罗索线虫雌、雄性比的变化,推测这3个基因在线虫发育过程中并不决定其性别分化,可能参与线虫的性腺发育。干扰gld-1基因的表达后fox-1、laf1、fem-1、egl-4表达量均无显著变化,mab-3、mab-5的表达量出现显著性上调的趋势,tra-2、tra-1、mab-7、的表达量出现显著性下调的趋势,说明gld-1可能处在tra-2、tra-1、mab-3、mab-7、mab、-5基因的上游位置;干扰mab-5基因的表达后不会引起fox-1、tra-2、fem-1、mab-3、egl-4表达量的变化,但是显著性上调laf-1的表达,显著性下调tra-1、mab-7、ggld-1,推测mab-5可能处于laf1、tra-1、mab-7、gld-1的上游;但干扰egl-4之后不会影响laf1、tra-2基因的表达,会使tra-1、mab-3、mab-7、mab-5出现显著性上调、fox-1、fem-1、gld-1出现显著性下调的趋势,说明egl-4可能处于fox-1、fem-1、tra-1、mab-3、mab-7、mab-5、gld-1的上游。为进一步验证这一推测,本实验选择了促进线虫雌性分化的fox-1基因对以上结果进行反证,将fox-1基因干扰后检测其它性别分化基因的表达,结果发现当fox-1下调表达后,laf1、tra-2、fem-1、mab-5、gld-1显著性上调,tra-1、mab-3、mab-7显著性下调,说明fox-1基因可能处于武昌罗索线虫性别决定通路起始上游位置,进一步证明egl-4和fox-1处于gld-1、mab-5的上游位置。综上所述,通过观察武昌罗索线虫寄生期的生长状况,发现寄生期3-5天的线虫发育速度较快,在这期间禁止喂食宿主,当宿主禁食2天后,线虫全部发育成雌性,推测寄生期3-4天是线虫营养决定性别分化的关键期。mab-5、gld-1、egl-4在寄生阶段均在雌线虫中高表达,说明这3个基因在雌性生殖腺的发育过程中发挥着重要的作用;干扰mab-5、gld-1、egl-4基因后会引起相关性别决定基因的变化,但是基因却呈现出无规律的变化,推测mab-5、gld-1、egl-4可能通过不同的调控途径参与武昌罗索线虫生殖系统的发育过程。这一研究结果为探明武昌罗索线虫营养决定性别分化的分子机理提供了参考资料。