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第一部分高脂喂养对糖尿病大鼠视网膜病变病理改变的影响目的:观察高脂喂养对糖尿病大鼠视网膜病变病理改变的影响,以期探讨血脂异常在DR发病机制中的作用。方法:建立糖尿病大鼠模型,随机分为四组:(A)非糖尿病大鼠+普通饲料喂养组;(B)非糖尿病大鼠+高脂饲料喂养组;(C)糖尿病大鼠+普通饲料喂养组;(D)糖尿病大鼠+高脂饲料喂养组。分别进行视网膜铺片、石蜡切片及透射电镜超微结构观察。结果:(1)视网膜血管铺片:A、B组未见异常改变,C组可见闭塞的无细胞毛细血管,周细胞数量减少,D组病变最为严重,可见多数闭塞的无细胞毛细血管及毛细血管无灌注区,周细胞的数量明显减少。(2)HE染色切片:A、B组未见异常改变;C组可见视网膜增厚,尤其内丛状层和视杆、视锥细胞层;D组病变最明显,细胞排列紊乱,内核层血管周围水肿,节细胞排列不规则,数目减少,静脉扩张、渗出,出血。(3)透射电镜观察:A、B组未见异常改变;C组可见内皮细胞、周细胞肿胀,毛细血管基底膜轻度增厚;D组可见内皮细胞、周细胞核异染色质浓集、居边,线粒体肿胀变性,甚至呈空泡状,管腔狭窄,视细胞外节盘膜结构紊乱,内节线粒体肿胀。结论:食饵性高脂血症对糖尿病大鼠视网膜病变病理改变的进程有非常重要的作用,提示高脂血症在DR的发生中起促进作用。第二部分脂质和糖参与糖尿病视网膜病变机制的研究第一章LPC和糖对牛视网膜微血管内皮细胞NO及NOS表达的影响目的:研究溶血磷脂酰胆碱(Lysophosphatidylcholine,LPC)和糖对牛视网膜微血管内皮细胞(Bovine retinal endothelial cell,BRECs)NO和NOS生成的影响,为进一步阐明脂毒性在DR发生中的作用提供一定的实验依据。方法:应用选择性培养基筛选细胞,差速黏附法纯化BRECs。培养的BRECs分三组:第一组:加入不同浓度的LPC(0-60umol/L);第二组:加入不同浓度葡萄糖(5.6、30 mmol/L)和甘露醇(20mmol/L);第三组:加入LPC(60umol/L)和高糖(30 mmol/L)。用NO和NOS试剂盒检测各组内皮细胞培养上清液中NO含量和NOS活性,RT-PCR法检测eNOS mRNA的表达水平。结果:①LPC(60umol/L)作用BRECs 24h后,与对照组比较,细胞培养基中NO含量、NOS活性和细胞eNOSmRNA表达水平较低(P＜0.05);②高糖(30mmol/L)作用BRECs 24h后,与对照组比较,细胞培养液中NO浓度、NOS活性和细胞eNOSmRNA表达水平下降(P＜0.01),相同渗透压的甘露醇对内皮细胞NO浓度和NOS活性无影响(P＞0.05);③LPC(60umol/L)和葡萄糖(30mmol/L)共同作用BRECs 24h后,与对照组比较,细胞培养液中NO含量、NOS活性和细胞eNOSmRNA表达水平明显降低(P＜0.01)。结论:LPC和高糖分别单独作用能够降低牛视网膜微血管内皮细胞NO和NOS的表达水平,且两种因素有协同作用,这可能是脂代谢紊乱参与DR发生发展的机制之一。第二章LPC和糖对牛视网膜微血管内皮细胞PDGF-B表达的影响目的:研究LPC和糖对BRECs表达PDGF-B的影响,为进一步阐明脂代谢紊乱在DR发生发展中的作用提供一定的实验依据。方法:原代培养的BRECs分三组:第一组:加入不同浓度的LPC(0-60umol/L);第二组:加入不同浓度葡萄糖(5.6、30mmol/L)和甘露醇(20mmol/L);第三组:加入LPC(60umol/L)和高糖(30mmol/L)。酶联免疫吸附试验(ELISA)检测各组内皮细胞培养上清液中PDGF-B蛋白的含量,RT-PCR法检测PDGF-B mRNA的表达水平。结果:①LPC(60umol/L)作用BRECs 12h后,与对照组比较,细胞培养液中PDGF-B含量和细胞PDGF-BmRNA的表达水平增加(P＜0.01);②高糖(30mmol/L)作用BRECs 24h后,与对照组比较,细胞培养液中PDGF-B含量和细胞PDGF-BmRNA的表达水平增加(P＜0.05),相同渗透压的甘露醇对内皮细胞PDGF-B蛋白表达无影响(P＞0.05);③LPC(60umol/L)和葡萄糖(30mmol/L)共同作用BRECs 12h后,细胞培养液中PDGF-B的含量和细胞PDGF-BmRNA的表达水平明显增加(P＜0.01)。结论:LPC和高糖分别单独作用能够增加牛视网膜微血管内皮细胞PDGF-B的表达水平,且两种因素具有协同作用。提示脂代谢紊乱参与DR发病的机制之一,可能是上调视网膜内皮细胞PDGF-B的表达,进而影响新生血管形成。