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PSP-Ⅱ是公猪精浆中含量较高的蛋白,且在猪副性腺特异表达并分泌到精液中,为了建立猪副性腺特异表达载体,根据已发表的PSP-Ⅱ5’和3’-调控区序列设计两对引物并引入酶切位点,用高保真PCR扩增了猪PSP-Ⅱ蛋白基因的5’端和3’端的调控元件及启动子,长度分别约为4.1kb和3.1kb,并将PSP-Ⅱ5’和3’-调控区序列分别克隆到pMD18-T Vector上,将插入目的片段重组质粒送上海基康生物技术有限公司进行测序,测序结果Blast程序与已发表的序列的相应区域进行比对,结果表明PCR扩增的PSP-Ⅱ5’端和3’端调控区前500bp与已发表的序列的同源性为99.8%、100%。为了建立猪附性腺暂态生物反应器,我们将已经克隆的PSP-Ⅱ基因5’端和3’端调控序列,应用体外DNA重组技术连接到改造过的pcDNA3.0上,经鉴定将正确的目的克隆命名为pC,然后将报告基因EGFP插入pC载体的PSP-Ⅱ5’侧翼区下游和3’侧翼区上游。为确定建立的载体是否表达及表达的特异性,将pC-EGFP质粒及阳性对照pEGFP-N1质粒分别经PEI包裹手术转染ICR小鼠精囊腺,转染48h后,取小鼠精囊腺并提取mRNA用RT-PCR方法和做冰冻切片用荧光显微镜检测荧光蛋白基因的表达情况,结果表明pC-EGFP质粒可以驱动EGFP基因的表达。为确定表达的特异性,将pC-EGFP质粒经PEI包裹尾静脉全身转染ICR小鼠,转染48h后,取精囊腺、肝脏、心脏、肺和肌肉提mRNA和做冰冻切片,用RT-PCR方法和荧光显微镜检测各组织荧光蛋白的表达情况,结果表明pC-EGFP真核表达载体具有很好的组织特异性。从而确定首次成功建立了猪附性腺特异表达荧光蛋白的载体。该载体的建立为猪附性腺高效表达技术体系深入研究奠定了基础。