研究背景及研究目的葡萄糖是哺乳动物能量代谢的重要物质。循环系统血液中的葡萄糖被简称为血糖。血糖的稳定是体内一切生理活动的基础,机体根据饮食状态的改变随时调控组织及细胞的葡萄糖摄取利用和内源性葡萄糖的输出释放,进而控制血糖的稳定。Ⅱ型糖尿病是一种以高血糖为主要临床表现的慢性代谢性疾病,病程长,并发症多,常引起血管损伤,胰岛素抵抗和糖脂代谢紊乱,危及心、脑、眼睛、外周神经等,甚至会诱导肿瘤的发生发展。体内氨基酸、乳酸等非糖物质经过一系列生物转化,最终生成为葡萄糖,这一生理过程被称为糖异生,糖异生是葡萄糖代谢活动的主要组成形式,对于维持哺乳动物空腹状态下的血糖稳定非常重要。不仅如此,在Ⅱ型糖尿病患者中,肝脏糖异生的持续激活是引起空腹血糖持续升高的主要原因。糖异生的进程主要受体内激素的调控。胰高血糖素是促进肝脏糖异生能力增强的重要激素。胰高血糖素可活化蛋白激酶 A(phosphorylation glucagon-cAMP-protein kinase A,PKA)通路,进而磷酸化cAMP反应元件结合蛋白(cAMP-response element binding protein,CREB),磷酸化的CREB可以与CREB结合蛋白及相关转录共激活因子p300(CREB binding protein and the related protein p300,CBP/p300)共同形成复合物,结合于糖异生关键基因启动子区域,启动糖异生关键基因的表达;同样,CREB磷酸化后会导致PGC-1α的表达量增加,PGC-1α和FOXO1形成复合物,作用于糖异生关键酶的启动子区域,增加糖异生能力;除此之外,ERK通过Ets-1促进FOXO1磷酸化和乙酰化降解,而胰高血糖素可以通过抑制肝细胞ERK信号通路,减少FOXO1降解,进一步增强糖异生作用。胰岛素是体内最重要的降血糖激素,胰岛素可以活化肝细胞内的P]3K,引起PIP3的增加,进而促进AKT的磷酸化活化,磷酸化的AKT导致FOXO1磷酸化,使其在胞浆中降解,从而抑制糖异生作用。也有文献报道,胰岛素刺激PGC-1α使其在丝氨酸位点的磷酸化水平增加,磷酸化的PGC-1α因不能与FOXO1结合,使得糖异生能力进一步下降。Ⅱ型糖尿病患者中,常常伴随这些激素信号通路的紊乱,尤其是胰岛素抵抗的发生,从而导致血糖代谢的异常。因此,寻找调节糖异生的分子靶点及探寻其作用机制,不仅可以更好地解释糖异生的生理调节过程,更为控制血糖、减少Ⅱ型糖尿病的发生提供理论和实验依据。TIPE2是TIPE(TNFAIP8)家族中的一员,优势表达于淋巴组织及免疫细胞,参与调节免疫和炎症,具有维持免疫稳态的作用。研究显示TIPE2主要表达在胸腺、脾脏、淋巴结和小肠粘膜等免疫细胞和淋巴细胞富集的部位。蛋白结构分析发现,TIPE2含有一个疏水状结构域,疏水性辅助因子和细胞因子可以结合在这个疏水状结构域中,进而发挥调节功能。功能研究发现,TIPE2基因敲除小鼠可自发多器官炎症与脾脏肿大。TIPE2可以负向调节巨噬细胞、树突状细胞、T细胞等免疫细胞介导的免疫及炎症反应。TIPE2基因敲除的巨噬细胞对病原菌吞噬能力和消化能力显著增强,同时也对LPS诱导的炎症反应更加强烈,表现为TNF-α、IL-6等细胞因子分泌能力的显著增强。最新研究表明,TIPE2基因缺失的中性粒细胞,在向炎症部位极化的过程中,表现为细胞骨架重塑不完全,迁移能力下降。在肿瘤的研究中发现,TIPE2参与肿瘤的发生发展,但在不同的肿瘤中功能不同,在胃癌、肺癌、肝癌等肿瘤组织中TIPE2表达下调且与肿瘤的生长、迁移呈负相关;但是在肾细胞癌和结肠癌组织中TIPE2表达上调,且与病程呈正相关。相关的机制研究发现,TIPE2参与调控Rac1、AKT、mTORC1、caspase-8、NF-κB和MAPK等多个信号通路。在代谢领域,TIPE2的研究相对较少。少量研究显示,在动脉粥样硬化疾病中,巨噬细胞内的TIPE2可以通过抑制MAPK和AKT信号通路减弱其对ox-LDL的反应性,减少泡沫细胞的形成。临床数据分析,Ⅱ型糖尿病患者的外周血单个核细胞内TIPE2的表达上调,且与TNF-α、IL-6等炎症因子的表达呈正相关。我们课题组在前期研究中发现TIPE2通过抑制Rac1的活性进而抑制肝癌的生长、迁移。但是TIPE2在正常肝细胞中的表达模式及其糖代谢生理功能尚不清楚。因此,我们在本研究中利用细胞模型和动物模型,探讨了 TIPE2调节肝脏糖异生的作用功能及内在机制,以期深入了解TIPE2的生理功能并探索其临床应用潜能。实验方法一、小鼠肝脏组织中TIPE2表达的检测及其与糖异生关键基因的相关性分析1.普通饮食及高脂饮食喂养小鼠的处理普通饮食喂养小鼠的禁食:6-8周野生型C57BL/6雄性小鼠,分为三组:正常喂食组、饥饿24小时组、饥饿24小时再喂食6小时组。处死后收集小鼠肝脏组织备用。饮食诱导肥胖的Ⅱ型糖尿病模型小鼠的禁食:7-8周野生型C57BL/6雄性小鼠,喂食高脂饮食(HFD)和普通饮食(ND)32周,记录小鼠体重,检测空腹血糖和丙酮酸耐量。饥饿16小时,处死小鼠收集肝脏组织备用。2.小鼠肝脏组织中TIPE2及糖异生关键基因的表达检测分别取上述各组小鼠肝脏组织,提取总RNA,用实时荧光定量PCR检测糖异生关键基因PEPCK、GaPase、PGC-1α和TIPE2的mRNA表达水平。蛋白质裂解液提取蛋白质,用western-blot检测TIPE2的蛋白质表达水平。3.小鼠肝脏组织中TIPE2与糖异生关键基因的相关性分析将实验小鼠肝脏组织中TIPE2基因与糖异生关键基因PEPCK、G6Pase、PGC-1α基因的mRNA表达水平分别进行相关性分析。二、TIPE2基因敲除小鼠的糖异生能力检测1.TIPE2基因敲除小鼠的鉴定与饲养繁殖TIPE2基因敲除小鼠饲养于山东大学实验动物中心,小鼠3周左右,通过改良碱裂解法试剂盒提取小鼠基因组DNA,普通PCR扩增,检测其基因型。2.检测TIPE2基因敲除对小鼠空腹血糖的影响6-8周TIPE2基因敲除小鼠和同窝对照野生型小鼠,通过尾静脉采血分别检测正常进食和禁食6小时后的血糖浓度。3.检测TIPE2基因敲除对小鼠糖异生的影响丙酮酸耐量实验:6-8周TIPE2基因敲除小鼠和同窝对照野生型小鼠,禁食6小时,腹腔注射丙酮酸钠后检测注射0、15、30、45、60、90及120分钟后的血糖浓度。丙氨酸刺激实验:6-8周TIPE2基因敲除小鼠和同窝对照野生型小鼠,禁食6小时,腹腔注射丙氨酸钠后检测注射0、60分钟后的血糖浓度。三、TIPE2对肝细胞糖异生功能的调控作用1.TIPE2基因的过表达对PEPCK、G6Pase基因的影响HepG2人肝癌细胞系,转染Flag-TIPE2过表达质粒(pRK5-Flag-TIPE2)和Mock质粒,质粒转染30小时后,更换为无血清M199培养基继续孵育16小时,经100μM pCPT-cAMP刺激6小时后收集细胞。实时荧光定量PCR检测TIPE2和PEPCK、G6Pase基因的表达。2.TIPE2基因的缺失对PEPCK、G6Pase基因的影响取TIPE2基因敲除小鼠和同窝对照野生型小鼠的原代肝细胞,细胞贴壁后孵育12小时,更换为无血清M199培养基继续孵育16小时,经10OμM pCPT-cAMP刺激6小时后收集细胞。实时荧光定量PCR检测PEPCK、G6Pase基因的表达。四、TIPE2调控肝细胞糖异生的通路探索1.构建鼠源TIPE2的表达质粒根据实验所需,构建鼠源TIPE2的表达质粒。载体质粒为pcDNA3.1,插入融合Flag的鼠源TIPE2片段。以野生型小鼠原代肝细胞的cDNA为模板,通过普通PCR扩增出TIPE2序列,并加上Flag序列和酶切位点EcoRI序列和HandⅢ序列,经酶切、胶回收、链接、转化、筛选,测序构建出目的质粒。2.TIPE2基因的缺失对AKT信号通路的影响6-8周TIPE2基因敲除小鼠和同窝对照野生型小鼠,收集喂食小鼠肝脏组织,蛋白质裂解液提取蛋白质并制成蛋白样,用western-blot检测p-AKT、AKT的蛋白质表达水平。取TIPE2基因敲除小鼠和同窝野生型小鼠的原代肝细胞,无血清培养基过夜后,经100nM胰岛素刺激0分钟、10分钟、30分钟,收集细胞。Western-blot检测p-AKT、AKT和TIPE2的蛋白质表达水平。3.TIPE2的过表达对AKT信号通路的影响HepG2细胞,转染Flag-TIPE2过表达质粒(pRK5-Flag-TIPE2)30小时后,更换为无血清培养基继续孵育16小时,经100nM胰岛素刺激0分钟、10分钟、30分钟,收集细胞。用western-blot检测p-AKT、AKT和Flag的蛋白质表达水平。AML12 细胞,转染 Flag-TIPE2 过表达质粒(pcDNA3.1-Flag-TIPE2)30 小时后,更换为无血清培养基继续孵育16小时,经100nM胰岛素刺激0分钟、10分钟、30分钟,收集细胞。用western-blot检测p-AKT、AKT和Flag的蛋白质表达水平。4.TIPE2基因的缺失对ERK信号通路的影响6-8周TIPE2基因敲除小鼠和同窝对照野生型小鼠,禁食饥饿24小时后收集肝脏组织,蛋白质裂解液提取蛋白质并制成蛋白样,用western-blot检测p-ERK、ERK和TIPE2的蛋白质表达水平。取TIPE2基因敲除小鼠和同窝对照野生型小鼠的原代肝细胞,贴壁12小时后换为无血清培养基,100μM pCPT-cAMP刺激60分钟,收集细胞。Western-blot检测p-ERK、ERK和TIPE2的蛋白质表达水平。5.TIPE2的过表达对ERK信号通路的影响HepG2细胞,转染Flag-TIPE2过表达质粒(pRK5-Flag-TIPE2)30小时后,更换为无血清培养基继续孵育16小时,经100μM pCPT-cAMP刺激60分钟,收集细胞。用western-blot检测p-ERK、ERK和Flag的蛋白质表达水平。AML12 细胞,转染 Flag-TIPE2 过表达质粒(pcDNA3.1-Flag-TIPE2)30 小时后,更换为无血清培养基继续孵育16小时,经100μM pCPT-cAMP刺激60分钟,收集细胞。用western-blot检测p-ERK、ERK和Flag的蛋白质表达水平。结果一、肝脏组织中TIPE2与糖异生关键基因的表达呈正相关1.禁食诱导小鼠肝脏组织中TIPE2的表达上调野生型C57BL/6小鼠分别采取给予不同的饮食状态后收集肝脏。qPCR结果显示,与正常喂食小鼠相比,禁食使得小鼠肝脏组织中TIPE2的表达和糖异生关键基因PEPCK、G6Pase、PGC-1α的表达在转录水平上显著上升,再喂食后这些基因则显著下降。Western-blot结果显示,与正常喂食小鼠相比,禁食小鼠肝脏组织中TIPE2的蛋白表达水平明显上升,而再喂食后TIPE2的表达则明显下降。以上结果提示我们TIPE2可能在小鼠饥饿诱导肝脏的糖异生过程中发挥作用。2.肝脏组织中TIPE2和PEPCK、G6Pase、PGC-1α的表达呈正相关我们对上述实验小鼠肝脏组织中TIPE2和糖异生关键基因的mRNA表达水平做了相关性分析。结果显示,小鼠肝脏组织中TIPE2和糖异生关键基因PEPCK、G6Pase、PGC-1α的mRNA表达水平均呈现明显的正相关关系。3.高脂饮食诱导小鼠肝脏组织中TIPE2的表达上调7-8周野生型C57BL/6小鼠,喂养高脂饮食(HFD)和普通饮食(ND)32周,发现HFD组小鼠体重显著高于ND组;HFD组小鼠的空腹血糖水平显著高于ND组,进一步的丙酮酸耐量实验结果显示,其糖异生能力显著高于ND组小鼠。进一步收集并检测上述小鼠肝脏组织中TIPE2的表达情况,qPCR结果显示,禁食16小时后,HFD小鼠肝脏组织中TIPE2在mRNA水平上的表达显著高于ND小鼠;western-blot亦显示HFD小鼠肝脏组织中TIPE2在蛋白水平上的表达显著高于ND小鼠。这些结果提示肝脏组织中的TIPE2分子可能参与Ⅱ型糖尿病中的糖异生过程。二、TIPE2基因缺失小鼠的糖异生能力下降1.TIPE2基因敲除小鼠的鉴定TIPE2基因敲除小鼠利用CRISPR-Cas9技术构建获得,TIPE2的第二个外显子中约1.2kb的基因片段被敲除。小鼠基因组DNA鉴定结果显示,仅扩增出5’端1820bp条带的为野生型小鼠;同时扩增出5’端1820bp条带和3’端695bp条带的为杂合子小鼠;仅扩增出3’端695bp条带的为TIPE2基因敲除小鼠。2.TIPE2基因敲除小鼠的空腹血糖浓度低于野生型小鼠给予6-8周TIPE2基因敲除小鼠和同窝对照野生型小鼠禁食6小时后发现,野生型小鼠仍能维持正常的血糖浓度,但TIPE2基因敲除小鼠的血糖浓度则显著下降。这提示TIPE2基因的缺失不利于饥饿小鼠对血糖的维持。3.TIPE2基因敲除小鼠糖异生能力低于野生型小鼠对TIPE2基因敲除小鼠和同窝对照野生型小鼠进行了丙酮酸耐量实验和丙氨酸刺激实验。结果显示,TIPE2基因敲除小鼠在注射丙酮酸和丙氨酸后其血糖水平都显著低于野生型小鼠,其曲线下面积亦具有统计学差异。这些表示小鼠TIPE2基因的缺失可导致小鼠的糖异生能力减弱。三、TIPE2促进肝细胞的糖异生功能1.TIPE2的过表达促进肝细胞PEPCK、G6Pase基因的表达利用HepG2细胞系,转染pRK5-Flag-TIPE2质粒和对照Mock质粒,无血清培养基孵育16小时后,经pCPT-cAMP(cAMP类似物)刺激6小时后收集细胞。结果显示转染pRK5-Flag-TIPE2质粒后,TIPE2的mRNA表达水平较Mock组显著升高。其中,在转染Mock质粒的HepG2细胞中,pCPT-cAMP可以明显诱导TIPE2的mRNA表达上调,提示我们饥饿小鼠肝脏组织中TIPE2的升高可能是源于肝细胞中TIPE2的表达上升。同时,qPCR结果显示,无pCPT-cAMP刺激时,两组细胞PEPCK、G6Pase的mRNA表达并无统计学差异;pCPT-cAMP可以显著诱导HepG2细胞系中糖异生关键酶基因的表达升高,其中TIPE2过表达细胞中PEPCK、G6Pase的mRNA表达水平显著高于Mock组。以上结果表明肝细胞中TIPE2的过表达会促进糖异生关键酶PEPCK、G6Pase基因的表达。2.TIPE2基因的敲除抑制肝细胞PEPCK、G6Pase基因的表达接下来,我们利用TIPE2基因敲除小鼠和同窝对照野生型小鼠的原代肝细胞,无血清培养基孵育16小时,以pCPT-cAMP刺激6小时后收集细胞。qPCR结果显示,无pCPT-cAMP刺激时,两组细胞PEPCK、G6Pase的mRNA表达水平无统计学差异;pCPT-cAMP刺激明显诱导野生型及TIPE2基因敲除小鼠原代肝细胞中PEPCK、G6Pase的mRNA表达水平升高,但TIPE2基因敲除小鼠的原代肝细胞中PEPCK、G6Pase的mRNA表达水平显著低于野生型小鼠。以上结果表明肝细胞中TIPE2基因的缺失可抑制糖异生关键酶基因的表达。四、TIPE2抑制肝细胞内糖异生过程中AKT和ERK的磷酸化1.构建鼠源TIPE2的表达质粒根据实验所需,我们构建了鼠源TIPE2的表达质粒。以野生型小鼠原代肝细胞中的cDNA为模板,通过普通PCR扩增出TIPE2序列,并加上Flag序列和酶切位点EcoRⅠ序列和Hand Ⅲ序列,经测序和western-blot确认pcDNA3.1-Flag-TIPE2质粒的基本信息。2.TIPE2基因缺失促进胰岛素诱导AKT的磷酸化为了明确糖异生过程中TIPE2与AKT的关系,我们检测了 TIPE2基因敲除小鼠和同窝对照野生型小鼠肝脏组织中AKT的磷酸化水平。结果显示,进食状态下,TIPE2敲除小鼠肝脏组织中AKT的磷酸化水平显著高于野生型小鼠。结果表明,肝脏组织中TIPE2可能通过抑制AKT的磷酸化从而促进糖异生。取TIPE2基因敲除小鼠和野生型小鼠的原代肝细胞,无血清培养基孵育16小时后,经胰岛素刺激0分钟、10分钟和30分钟,收集细胞。Western-blot结果显示,胰岛素可以显著的诱导原代肝细胞AKT的磷酸化,其中TIPE2基因敲除小鼠原代肝细胞中AKT的磷酸化水平高于野生型小鼠原代肝细胞。提示肝细胞中TIPE2基因的缺失可以促进胰岛素诱导AKT的磷酸化。3.TIPE2的过表达抑制胰岛素诱导AKT的磷酸化人HepG2细胞系和小鼠AML12细胞系,过表达Flag-TIPE2质粒,无血清培养基孵育16小时后,经胰岛素刺激0分钟、10分钟和30分钟,收集细胞。Western-blot实验结果显示,在胰岛素刺激10分钟和30分钟后,HepG2细胞和AML12细胞中的AKT磷酸化水平显著升高,但过表达TIPE2质粒细胞中AKT的磷酸水平显著低于Mock组细胞。以上表明提示肝细胞中TIPE2的过表达后会抑制胰岛素诱导AKT的磷酸化活化。4.TIPE2基因缺失促进肝细胞中ERK的磷酸化为了明确糖异生过程中TIPE2与ERK的关系,我们检测了 TIPE2基因敲除小鼠和同窝对照野生型小鼠肝脏组织中ERK的磷酸化水平。Western-blot结果显示,禁食24小时后,TIPE2基因敲除小鼠肝脏组织中ERK的磷酸化水平显著高于野生型小鼠。提示肝脏组织中TIPE2亦可能通过抑制ERK的磷酸化从而促进饥饿诱导的糖异生进程。取TIPE2基因敲除小鼠和野生型小鼠原代肝细胞,无血清培养基孵育16小时后,经pCPT-cAMP刺激60分钟收集细胞。Western-blot结果显示,无pCPT-cAMP时,两组肝细胞中ERK的磷酸化水平无明显变化;pCPT-cAMP的刺激可以使小鼠原代肝细胞中ERK的磷酸化水平下降,但是TIPE2基因敲除小鼠原代肝细胞中ERK磷酸化水平则显著高于野生型小鼠原代肝细胞,这提示在肝细胞中TIPE2基因的缺失可以减弱pCPT-cAMP对ERK磷酸化的抑制。5.TIPE2的过表达抑制肝细胞中ERK的磷酸化在人HepG2细胞系和小鼠AML12细胞系,过表达Flag-TIPE2质粒,无血清培养基孵育16小时后,经pCPT-cAMP刺激60分钟后收集细胞。Western-blot结果显示,pCPT-cAMP的刺激可以使HepG2细胞和AML12细胞中ERK的磷酸化水平下降,其中TIPE2过表达的细胞中ERK磷酸化水平显著低于Mock细胞。这提示在肝细胞中TIPE2的过表达可以增强pCPT-cAMP对ERK磷酸化的抑制。结论1.禁食饥饿可以诱导小鼠肝脏组织中TIPE2的表达上调。2.禁食饥饿时,高脂饮食小鼠肝脏组织中TIPE2的表达高于普通饮食小鼠。3.TIPE2基因敲除小鼠的空腹血糖水平和糖异生能力显著低于野生型小鼠。4.TIPE2促进肝细胞中糖异生关键酶基因的表达。5.TIPE2抑制肝细胞中AKT和ERK的磷酸化活化,参与促进糖异生。