拟南芥AtMGT4功能的初步研究

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AtMGT4是拟南芥镁离子转运基因家族的成员之一,其开放阅读框含有1455个脱氧核糖核苷酸对,编码484个氨基酸。实验室的前期研究表明AtMGT4能恢复MM281(缺乏Mg2+转运系统)细菌突变株转运Mg2+的功能,但AtMGT4在拟南芥体内的转运特性、转运机制等缺乏相关研究。本论文利用GFP融合蛋白、组织化学染色、半定量RT-PCR、酵母双杂交等实验技术对AtMGT4的功能进行了初步研究。利用GFP-AtMGT4融合蛋白转化拟南芥叶肉细胞原生质体,在荧光显微镜下观察到AtMGT4蛋白定位于细胞核上。利用转基因技术获得AtMGT4pro:GUS转基因拟南芥,通过X-Gluc显色分析,发现AtMGT4集中在根尖、茎根过渡区、子叶顶端、花药、胚珠等部位表达。对AtMGT4 T-DNA插入突变体GK-142H10、GK-366F02的植株进行鉴定,获得纯合突变体。GK-142H10突变体有两个T-DNA插入位点,分别位于AtMGT4基因上游-55 bp、-92 bp处;GK-366F02突变体中T-DNA插入位点位于AtMGT4上游-93 bp处。半定量RT-PCR表明,GK-142H10突变体内的AtMGT4转录水平没有发生显著变化,而GK-366F02突变体内的AtMGT4转录水平显著上调,表明GK-366F02株系实为AtMGT4 T-DNA插入过表达突变体。利用转基因技术获得了35S:AtMGT4过表达转基因植株,命名为MGT4-ox。将其与GK-366F02植株同时在低镁条件(10μM Mg2+)下培养,发现二者皆出现植株偏小、主根较短、侧根稀少的表型,表明AtMGT4过量表达会导致拟南芥出现此特定表型。将GK-366F02植株在低镁条件下培养,利用FAAS法分别测定植株整株、根、叶中的Mg2+浓度,结果表明,在低镁环境下生长,GK-366F02植株内Mg2+浓度较WT低,根部的Mg2+浓度与WT一致,叶的Mg2+浓度显著低于WT。将GK-366F02植株由正常水培液(1 mM Mg2+)移至低镁水培液(10μM Mg2+)中进行低镁诱导。半定量RT-PCR结果表明GK-366F02植株受低镁诱导2天后,根部AtMGT1、AtMGT2、 AtMGT3、AtMGT6、AtMGT10转录水平显著下降。利用酵母双杂交技术从拟南芥cDNA文库中筛选与AtMGT4相互作用的蛋白,得到了若干个可能与AtMGT4相互作用的蛋白序列。通过对这些候选蛋白的自激活检测,初步验证其中2个蛋白与AtMGT4存在相互作用:At1g61170和At5g13980。Atlg61170蛋白功能未知,SUBA数据库预测其定位于细胞核上;At5g13980为糖基水解酶家族一成员。总之,本研究表明在低镁环境中,拟南芥体内AtMGT4过量表达导致AtMGT1、AtMGT2、AtMGT3、 AtMGT6、AtMGT10的转录水平下降,并影响Mg2+从根部向叶转运的过程。
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