外源赤霉素处理促进三倍体枇杷坐果分子机制初探

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枇杷(Eriobotrya japonica Lindl.)属于蔷薇科枇杷属植物。三倍体枇杷由于配子母细胞减数分裂异常,难以形成正常的花粉,造成花粉败育而不能正常授粉受精,导致三倍体枇杷自然坐果率极低,生产上常通过外源赤霉素(Gibberellin,GA3)处理来提高坐果率。本研究以三倍体枇杷A322无性繁殖株系为试验材料,喷施外源赤霉素及内源赤霉素合成抑制剂多效唑(Paclobutrazol,PAC)处理,以清水处理为对照,分析了不同处理后三倍体枇杷坐果率、子房壁厚度等,子房和其它部分5种内源激素(IAA,ABA,GA3,KT和SA)含量以及成熟果实品质等指标;选取外源处理14天后各处理子房部分进行转录组测序,分析其转录模式;最后结合转录组数据克隆了赤霉素代谢相关GA3ox1、GA2ox1和DELLA基因CDS全长序列,并进行表达模式分析和功能验证。主要研究结果如下:1、外源赤霉素对三倍体枇杷生长发育的影响(1)外源GA3处理后,三倍体枇杷坐果率显著提高,平均坐果率69.66%;GA3+PAC处理后平均坐果率48.04%;对照组坐果率仅为1.55%。(2)坐果期形态学观察发现,外源GA3处理后14-21d为坐果关键期,在14d时,GA3和GA3+PAC处理组萼片开始闭合,外源GA3处理的幼果单果重急剧增加,子房壁细胞明显膨大,而对照组开始褐化枯萎。(3)在子房中,GA3处理组内源GA3和KT含量降低,内源IAA含量增加,内源ABA含量低于检测下限未检出;GA3+PAC处理组IAA含量显著高于GA3处理组。在除子房外的其它部分中,对照组内源ABA在坐果期含量较高。而GA3处理和GA3+PAC处理对内源SA无显著影响。(4)外源GA3处理后,成熟果实的果形指数增加,呈长椭圆形;GA3+PAC处理与GA3处理相比,果形指数无显著变化。外源GA3处理对可溶性固形物含量和Vc含量无显著影响,糖组分(转化糖、还原糖和总糖)含量显著增加,可滴定酸含量降低,糖酸比显著提高。而添加PAC处理后抑制了外源GA3的效应。表明外源GA3处理能够提高三倍体枇杷果实的品质。2、赤霉素诱导三倍体枇杷坐果转录模式分析转录组测序结果表明,对照组与GA3处理组共筛选出9713个差异表达基因,对照组与GA3+PAC处理组的差异表达基因数目为6811个,GA3处理组和GA3+PAC处理组的差异表达基因数目最少(3199个)。表明在果实坐果关键期外源赤霉素起到关键作用,外源赤霉素能够引起植物体内基因表达的变化。差异基因富集分析发现,对照组和GA3处理组差异表达基因主要集中在植物激素信号转导、戊糖与葡萄糖醛酸的相互转化、苯丙素类生物合成、淀粉和蔗糖代谢、单萜类化合物的生物合成等途径,筛选出植物激素信号转导差异表达基因39个,主要是生长素、赤霉素、乙烯、细胞分裂素等植物内源激素合成与调控基因,以及Bhlh、NAC、WRKY、GARS、ARF等转录因子。表明植物内源激素调控与三倍体枇杷坐果密切相关。3、赤霉素氧化酶基因和DELLA基因的序列结构、表达模式和功能分析从三倍体枇杷中成功克隆了EjGA3ox1、EjGA2ox1和EjDELLA基因CDS全长序列。生物信息学分析结果表明,它们都具有各基因所特有的保守氨基酸残基或结构域。亚细胞定位显示EjGA3ox1、EjGA2ox1在细胞核和细胞质中均有分布,EjDELLA只定位于细胞核。通过表达模式分析发现,外源GA3处理后GA20ox1、GA3ox1表达量显著上升,而GA2ox1、DELLA、ARFs(ARF5/6/7)表达量显著降低,ARF8表达量无变化。表明外源GA3处理负反馈调节GA20ox1、GA3ox1和GA2ox1,正向调控DELLA和ARFs的表达。本研究成功构建了EjGA3ox1、EjGA2ox1和EjDELLA基因超表达载体,获得了T0代转基因拟南芥种子。
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