3D细胞培养用透明纸的制备及应用研究

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三维(3D)细胞培养能够较为准确地模拟体内微环境,对于研究细胞生命活动具有重要的意义。纤维素纸因其具有丰富廉价、生物相容性好、高孔隙率等优点,可以为细胞的生长提供足够的空间,且能够通过纸张的堆叠和拆分简单实现2D和3D环境的转换,因此,纸张作为一种3D细胞培养平台在药物筛选、构建疾病模型、修复组织缺陷等方面得到了广泛的应用。然而,由于纸张中纤维的各向异性排列造成的光散射,对细胞观察造成了阻碍,导致细胞图像分辨率不高,限制了纸张在细胞培养中的应用。此外大多数纸张由于缺乏细胞粘附而不适宜细胞培养。且纤维素纸张长期暴露于培养液中会破坏纤维之间的结合并导致细胞损失。因此,本研究意在制备一种水下透明度高、力学强度高、细胞粘附性好的高性能纸基材料,开发3D纸基细胞培养平台,从空间上分析细胞的生长和迁移,拓宽纸张在生物医药方面的应用。主要研究内容如下:(1)纤维素透明纸的制备与性能比较。采用棉纤维和微晶纳米纤维素为原料,通过TEMPO氧化法和溶解再生的方法制备TEMPO氧化透明纸、溶解再生纤维素透明纸、纳米纤维素透明纸,分析比较纸张的孔径结构、透光率和力学性能等。结果表明:TEMPO氧化法制备的透明纸具有多孔结构,但是在光学显微镜下能够清楚地观察到粗且长的纤维,透光率较差,对观察细胞造成阻碍,且在水中极易吸水润胀导致纸张结构破坏。而再生纤维素透明纸具有较大而不均一的孔径,水下透光率可达80%,但是在光学显微镜下仍然能够观察到细长的纤维,且孔径难以调控。采用微晶纳米纤维素制备的纸张在光学显微镜下观察不到纤维结构,且具有优异的水下透明度,透光率>90%,长期浸泡在水中能够保持原有形状和结构不发生明显变化。因此得出微晶纳米纤维为制备透明纸的合适原料,溶解再生法能够保持材料在水中长时间的结构稳定性。(2)用于细胞培养的透明纸的制备与性能研究。采用微晶纳米纤维素作为原料,通过溶解纤维素,在再生纤维素的过程中添加致孔剂的方法制备纤维素多孔透明纸,对其孔径结构、透光率、力学性能和生物相容性等进行测试。本研究制备了孔隙率分别为77%、79%和90%,孔径分别为23μm、36μm和46 μm的纸张,发现其在空气中呈现白色,但是在水中的透光率能够达到95%以上。未处理的纸张力学性能较差,拉伸强度不足1 MPa,在水中搅拌2天后结构被破坏,而采用聚乙烯醇(PVA)处理纸张后,拉伸强度提高了 3倍,且在水中搅拌7天后,纸张结构未出现明显变化。CCK-8法和细胞染色法结果显示,细胞在含有透明纸的环境中培养1/3/5/7天后,存活率一直高达95%以上,说明该纤维素多孔透明纸具有良好的生物相容性。(3)3D纸基细胞培养平台的构建和可行性研究。为了增强材料对细胞的粘附,利用明胶处理纤维素多孔透明纸。结果表明,涂覆明胶后,纸张上的细胞密度明显增大,粘附性增强。分别在1/2/3/4/5层纸基细胞培养平台上孵育乳腺癌细胞,在光学显微镜和荧光显微镜下观察细胞的生长状况。结果显示,与滤纸相比,通过本研究制备的透明纸能够在光学显微镜下更清楚地直接观察到细胞。且在透明纸上细胞的荧光显微镜图像分辨率明显大于滤纸上的分辨率。利用多层纸张堆叠构建3D环境,将纸张层层剥离,通过光学显微镜和荧光显微镜观察每层的细胞,在空间尺度上分析细胞的生长。研究发现,细胞能够沿着纸张厚度向下生长和迁移,细胞迁移的数量与初始的细胞接种密度和纸张厚度有关。
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