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由古巴假霜霉菌（Pseudoperonospora cubensis Rostow）引起的黄瓜霜霉病（Downy mildew）是当前严重影响黄瓜生产的主要病害之一，1868年首次被发现，近年来日趋严重。防治霜霉病可采取喷施杀菌剂和高温闷棚等措施，但根本途径是培育抗霜霉病的黄瓜优良品种。克隆和标记黄瓜霜霉病抗病基因，则是当前利用分子技术进行抗病育种工作的基础。本试验采用基于抗病基因同源序列（Resistance gene analog, RGA）克隆和标记基因的策略，主要进行了以下3方面的研究：（1）依据抗病基因的NBS保守域设计简并引物，从黄瓜基因组DNA中克隆RGA；（2）构建黄瓜抗感霜霉病分离群体，并用于从上述克隆到的RGA中筛选黄瓜霜霉病抗病基因的连锁标记；（3）利用获得的黄瓜RGA分析黄瓜的种质资源，考察RGA在黄瓜抗病种质资源上的聚类分析效果。本试验首先参照文献报道，引用和设计了12条对应NBS类保守域P-loop、kinase2、kinase3a和HD等4个亚结构域的简并引物，采用SDS方法提取了黄瓜栽培品种津春4号和649的基因组DNA作为模板，通过PCR方法以及琼脂糖凝胶回收纯化技术，分别获得约270bp、340bp和540bp的目的扩增产物，将其与pMD18-T载体连接并转化JM109大肠杆菌，经过蓝白斑初步筛选，各自随机挑取72个阳性重组克隆进行菌培养和质粒提取，经过限制性酶切和PAGE方法分类，测序了其中60个克隆，经过在GenBank上使用Blast搜索和比对同源序列，最终确定其中15个克隆为黄瓜RGA片段，分别命名为CsRGA1～15，提交GenBank，获得登录号分别为AY555482~AY555495和AY545993。其中CsRGA5包含全部上述4个亚结构域，长度520bp；CsRGA2包含3个亚结构域，长度336bp；其余CsRGA只包含2个亚结构域，长度168~288bp。10个CsRGA为可完全翻译序列，5个CsRGA内部含终止密码，为不可完全翻译序列。使用PCR方法验证了全部CsRGA在供试样本基因组的存在。10个可通读CsRGA与公布的甜瓜RGA之间存在较高的同源性，显示出两者同属的亲缘关系。为从CsRGA中筛选黄瓜霜霉病抗病基因标记，分别以631和L18为感病亲本、649和129为抗病亲本，构建了4个以631×649和L18×129为杂交组合的霜霉病抗感性状的自交和回交分离群体，使用基于CsRGA1~15设计的特异引物，在上述群体中进行常规PCR扩增，在琼脂糖凝胶上获得多态性电泳谱带；为考察筛选引物的标记效果，同时进行了已公布黄瓜霜霉病抗病基因SCAR标记SCBC519和SCBC526的PCR扩增和分析。群体内各单株的DNA采用SDS微量简易提取法提取，抗病等级采用子叶点滴人工接菌法鉴定。连锁分析使用MAPMAKER/EXP3.0版本分析软件。结果显示：L18×129 F2回交分离群体（L18为回交亲本）、631×649 F2自交分离群体（单株数86）和L18×129 F2自交分离群体（单株数77）的霜霉病抗感性状都有合适的分离比值（1:1和1:3），在L18×129 F2自交<WP=10>分离群体上得到较好的连锁标记，从15个CsRGA中筛选到与抗病基因dm连锁不十分密切的CsRGA3标记。在dm和CsRGA3之间还检测到黄瓜白粉病抗病基因pm的存在，显示了dm和pm存在连锁关系。本试验为研究植物RGA在种质资源分析方面的效果，特别是标示抗感病品种资源的作用能力，选择了24个黄瓜主要栽培品种进行标记聚类分析。所使用的标记为CsRGA3、BC519和BC526等3种标记（后两者为已公布的dm的RAPD标记），采用普通PCR方法扩增产物，琼脂糖凝胶电泳观察多态性谱带，并使用MVSP 3.13分析软件对谱带进行UPGMA聚类分析，以70％相似性（similarity）为域值，将供试品种划分为4类。与黄瓜霜霉病人工接菌鉴定结果相对照发现，3个标记可以明确标示出高感霜霉病黄瓜品种（长春密刺和L18），但对中抗和高抗类型分辨不够清晰。表明此种专项种质资源的分析方法基本可行。本试验在实验方法上有所创新。首次采用PCR-PAGE方法对RGA的克隆进行分类，与四碱基酶切分类方法相比较，该方法能够全面分析待测的克隆核苷酸序列，PCR扩增不受载体序列干扰、无需酶切鉴定可以直接去除非重组克隆，同时还可以对重组克隆进行是否为目的片段克隆的PCR验证。该方法在对电泳谱带的分析上也比较简便，只需对目的电泳带进行长度的归类，借助图象扫描分析软件可轻易完成。综上所述，本试验证实了NBS类型RGA在黄瓜基因组中广泛存在，并与甜瓜RGA有较高同源性；本试验还初步验证了黄瓜RGA同某些抗病基因之间可能存在的连锁关系；本试验还首次尝试使用RGA的特异引物分析植物品种间的遗传关系，初步证明黄瓜RGA对抗病种质有一定的标示作用。