背景淀粉样变是由多种血清蛋白的低分子量亚单位(5-25 k D)组成的细胞外组织纤维沉积为特征的一组疾病。系统性淀粉样沉积的两个最常见原因为免疫球蛋白轻链(AL)淀粉样变(既往称为原发性淀粉样变性)及淀粉样蛋白A(AA)淀粉样变。AL淀粉样变性是系统性淀粉样变性中最常见的形式,以血浆细胞衍生的单克隆轻链(light chain,LC)被分泌到循环中并自聚集成淀粉样蛋白原纤维,沉积在局部或全身器官中,可致器官功能障碍及机体死亡的一种疾病。AL淀粉样蛋白侵袭心脏是最常见并最致命的临床表现,大约50%的AL患者存在心脏浸润,临床特征表现为限制性心肌病,最终发展为充血性心力衰竭。若未经治疗,其中位生存期仅为6个月,五年存活率约10%。诊断心肌淀粉样变性的金标准为心内膜下心肌活检,超声心动图可协助诊断,其典型表现为心室壁弥漫性增厚,可见散在强回声的粗颗粒,室壁搏动减弱,左右房增大,但心室扩张不明显,即呈现“大心脏小心腔”表现,左室收缩功能多数正常,但舒张功能显著减退。钆增强心脏磁共振能直观反映心脏疤痕或淀粉样变浸润的范围,较之超声心动图具有独特的优势。然而,诱导心脏淀粉样变性的综合分子机制尚不清楚。最近的研究表明,心肌细胞中增加的活性氧物质(ROS)由LC诱导产生,导致细胞舒张功能受损及细胞凋亡。Jianru Shia的研究证实P38 MAPK通路是诱导淀粉样变心肌病心功能不全的重要通路。Helen P的研究表明,LC可诱导心肌细胞代谢异常。另外一些学者还探讨了心脏淀粉样变性的众多机制,包括氧化应激,线粒体功能障碍,溶酶体和自噬受损,收缩力和钙负荷改变等。心脏淀粉样变性病的遗传学改变在近些年研究中还没有得到证实。在过去的十年,微阵列基因表达谱分析为心血管疾病的诊断、治疗和预后提供了许多有用的信息。在本研究中,我们通过微阵列分析研究了心肌细胞模型中淀粉样心肌病的差异性表达基因(differentially expressed genes,DEGs)。利用基因本体和通路分析进一步分析了部分DEGs的作用。TGF-b途径在该疾病的发生和发展中起重要作用,BMP4和BMP6是该途径中两种重要的功能蛋白。BMP4和BMP6表达的增加与该途径的激活密切相关,导致组织的功能和结构改变并导致终末期心力衰竭的发展。我们的研究结果可能为心脏淀粉样变性的基因水平提供一种新的认识,以探索进一步的治疗。目的为研究淀粉样变蛋白引起心肌细胞功能及结构异常的发生机制,本实验利用体外培养乳鼠心肌细胞,分别以心肌淀粉样变性患者血清和表达合成的AL-09轻链蛋白干预,应用基因芯片表达谱筛选表达差异基因,验证并探索其可能的分子机制。方法1.淀粉样变轻链蛋白AL-09合成表达和血清样品采集AL-09蛋白是一种淀粉样变轻链蛋白,由LA Sikkink等从心脏受累的多发性骨髓瘤患者尿液中提取。我们使用与报道文献相同的方法重组AL-09蛋白,并在其N端添加了His标签。该蛋白由南京金丝瑞公司表达合成。纯化后的蛋白质在-80℃下保存。淀粉样变患者血清采自南京医科大学第一附属医院心血管内科心肌淀粉样变患者;对照组血清采自体检正常人。标本采集经患者书面知情同意书。本研究经南京医科大学第一附属医院伦理委员会批准(批准文号为2016SR169)。2.原代心肌细胞提取无菌条件下提取出生1-3天的Sprague Dawley(SD)乳大鼠心肌细胞。予心肌细胞消化液消化,分离和提取。90%以上高浓度心肌细胞用心肌细胞培养液培养。细胞计数板计数,调整细胞数至3?105/ml,最后将细胞接种至培养板中。3.大鼠心肌细胞淀粉样变性模型的建立细胞分为蛋白组和血清组,蛋白组分别予淀粉样变蛋白AL-09和His短肽培养,血清组分别予淀粉样变血清和正常血清培养。将培养细胞放置于37°C,5%CO2培养箱培养48 h后以无血清DMEM饥饿6-8 h,control组继续用无血清DMEM培养48 h,血清组以无血清DMEM细胞培养液10倍稀释人血清后培养48h,蛋白组予无血清DMEM细胞培养液配置成不同浓度后培养48h。每组设6个复孔。4.CCK-8检测各组细胞活性抑制情况:将各组细胞按3(?)105/孔的密度接种于96孔板,实验干预结束后应用CCK-8法检测各组细胞活性抑制情况。5.流式细胞术定量检测细胞凋亡将蛋白组心肌细胞接种于24孔板中48小时。通过Annexin V Alexa Fluor647/PI/凋亡检测试剂盒(Fcmrcs,南京)测定细胞凋亡率。使用流式细胞仪(BD FACSCalibur,USA)评估凋亡率。6.基因芯片检测及QRT-PCR验证取蛋白组和血清组干预后的乳大鼠心肌细胞,由广东瑞博公司提取总RNA、基因芯片筛查差异基因、并运用GO功能分析和Pathway信号通路富集来分析差异基因的生物学功能以及参与的信号通路。重点关注与TGF-b通路相关的m RNA、p53信号通路,细胞周期及细胞迁移和增殖相关基因。采用QRT-PCR验证上述部分结果。结果1.AL-09诱导心肌细胞中的细胞凋亡为了评估各组细胞的细胞活力,我们分析了AL-09蛋白和患者血清对心肌细胞活性的影响。使用cck8实验评估细胞活力。在检测cck8之前,通过普通光学显微镜在400倍镜下拍摄各组细胞镜下图像。AL-09蛋白最高浓度干预时(0.2mg/ml)的心肌细胞碎片较其他组明显增多。其他组镜下差异不明显。在cck8实验中,AL-09蛋白质0.2mg/ml浓度培养的心肌细胞的存活率显著低于对照组(P<0.05)。该试验还证实病人血清组的细胞存活率显著低于正常血清对照组(P<0.05)。接下来我们验证了AL-09是否通过凋亡机制诱导细胞死亡。使用膜联蛋白V/PI双标记来检测PS,显示细胞早期凋亡。与cck8检测一致,结果显示AL-09蛋白引起细胞凋亡而不是坏死,并且与对照组相比,早期凋亡细胞比例占大多数(P<0.05)。2.鉴定差异表达基因(DEGs)基因芯片结果提示:在蛋白组和基因组中显示有256个相同的变化的DEGs。通过基因富集途径分析分析了包括127个上调基因和88个下调基因的256个基因。在差异基因芯片表达谱中,两组共同变化的差异表达基因中包括BMP4,BMP6,PTGS1,PTGS2,EREG,TGFA,PLOD2,LBP表达上调,差异有统计学意义(P<0.05)。CCNB1,RRM2,PTTG1,CDKN2C表达下调,差异有统计学意义(P<0.05)。在上调的DEGs中,主要高功能富集度的差异表达基因与钙离子不规则运输成胞浆,蛋白激活级联,生长因子活性,过氧化氢酶活性,膜锚定成分改变相关。这些基因参与信号转导,代谢,细胞凋亡,粘附和心脏生理学过程。KEGG通路分析结果包括氨基糖和核苷酸糖代谢,赖氨酸降解,TGF-b信号通路和Erb B信号通路。在下调的DEGs中,主要的高功能富集分析差异表达基因与细胞周期和细胞收缩功能相关。这些基因参与细胞增殖和心脏收缩舒张过程。KEGG通路分析结果显示差异表达基因与p53信号通路,细胞周期,卵母细胞减数分裂,嘌呤代谢相关。3.基因芯片结果提示在这项研究中,通过基因芯片技术筛选与淀粉样心肌病发展有关的DEGs。TGF-b途径在该疾病的发生和发展中起重要作用。BMP4和BMP6是该途径中两种重要的功能蛋白。BMP4和BMP6的表达增加与TGF-b信号通路的激活密切相关,导致相关组织的功能和结构改变以及终末期心力衰竭的发展。结论1.心肌淀粉样变血清及蛋白AL-09干预实验,可引起乳大鼠心肌细胞活力较对照组相比明显降低,同时实验组细胞早期凋亡率增加。2.实验组p53信号通路,细胞周期,卵母细胞减数分裂,嘌呤代谢通路基因表达下调,氨基糖和核苷酸糖代谢,赖氨酸降解,TGF-b信号通路和Erb B信号通路相关基因表达及信号通路激活。3.BMP4和BMP6介导的TGF-b信号通路可能参与乳大鼠心肌细胞早期病变的病理过程。