恶性肿瘤已成为导致人类死亡的主要疾病之一。姜黄素是传统中药姜黄根茎的主要多酚类化合物,具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化、抗动脉粥样硬化和抗抑郁等生物活性,且安全性好。姜黄素选择性杀伤部分肿瘤细胞,已成为全球天然抗肿瘤药物研究的热点。巨自噬(简称“自噬”)是一种真核细胞防御和应激调控的生物学机制,与肿瘤发生发展存在较为复杂的关系。最近研究证实姜黄素能诱导细胞自噬,但其分子机制及细胞自噬在姜黄素抗肿瘤治疗中的意义并不清楚。p53是生物体内抑制正常细胞转变肿瘤细胞最为重要的抑癌基因之一,p53基因丢失或突变已被证明是肿瘤发生的普遍性事件。p53也是参与调控多种细胞自噬相关基因(ATGs)的重要的转录因子,对细胞自噬具有双向调控作用。这些研究也使p53在肿瘤中的作用和意义变得复杂化。CSN5是细胞重要的COP9信号复合体(CSN)的一重要组分,同时也是一个已知与p53相互作用的蛋白,其结合促进p53蛋白进入泛素化降解途径,因此,CSN5被认作是细胞一个内在p53功能抑制因子,在多种肿瘤细胞中异常高表达。CSN5已被公认为姜黄素一个特异性靶蛋白。实验研究证实姜黄素诱导CSN5表达下调同时伴随p53蛋白诱导性聚集和肿瘤细胞凋亡,姜黄素调控CSN5/p53的细胞生物学功能、与姜黄素诱导细胞自噬的关系及其在姜黄素抗肿瘤中的意义并未阐明。为此,本文综述了姜黄素和细胞自噬在抗肿瘤治疗方面的研究概况。在多种细胞模型和动物模型上,重点研究姜黄素调控细胞自噬的分子机制及其在抗肿瘤治疗中的意义。本文研究证实,30μM姜黄素可诱导人肝癌细胞HepG2和人宫颈癌细胞HeLa发生自噬,表现为p62蛋白表达下调、微管相关蛋白1轻链3(LC3)-Ⅰ向LC3-Ⅱ转变、以及细胞自噬小体增加,具有一定的时效关系。进一步研究发现,姜黄素与临床抗肿瘤药物如鬼臼毒素(Etoposide、50和100 μM、12 h)、顺铂(Cisplatin、15和30 μM、12 h)和5-氟尿嘧啶(5-Fluorouracil、5-FU、200和400 1μM、12 h)作用不同,它可诱导HepG2细胞CSN5蛋白的下调,提示下调CSN5可能是姜黄素杀伤肿瘤细胞特异性作用途径。同时,姜黄素可提高HepG2细胞p53蛋白的表达水平。CSN5 siRNA转染也可诱导HepG2细胞p53蛋白表达水平显著升高及细胞产生自噬。但HepG2细胞感染CSN5-V5 tag慢病毒使其稳定表达后可逆转姜黄素(15和30 μM、6h)所诱导p53蛋白表达水平的升高和细胞自噬的产生。这些研究结果提示姜黄素对肿瘤细胞可能存在诱导CSN5下调稳定p53蛋白,从而促进细胞自噬途径。本文另一研究的重点首先是探明姜黄素诱导细胞自噬与p53蛋白之间的关系。p53 siRNA转染可显著抑制15和30 μM姜黄素、CSN5 siRNA转染所诱导HepG2细胞p62蛋白的表达下调和自噬小体的形成,提示姜黄素所诱导细胞自噬依赖p53蛋白表达。为进一步验证此发现,本文用15和300M姜黄素分别处理p53阳性结肠癌细胞HCT116wt和其对应的p53阴性肿瘤细胞HCT116p53-/-,发现姜黄素仅引起HCT116wt细胞p62蛋白表达下调和自噬小体的形成,但对HCT116p53-/-细胞未产生诱导效应。这些研究结果表明姜黄素可引起肿瘤细胞CSN5下调,进而升高p53蛋白表达水平,从而引起细胞自噬。其次,探询姜黄素诱导肿瘤细胞自噬是否依赖p53转录活性。本文比较姜黄素和鬼臼毒素诱导HepG2细胞p53转录活性。双荧光素酶报告基因检测发现随着时间延长(3、6、9、12和18h),30μM姜黄素和80μM鬼臼毒素均提高HepG2细胞p53蛋白表达水平,且前者作用更为显著；但鬼臼毒素可显著升高HepG2细胞p53转录活性,而姜黄素却未产生类似效应。RT-PCR分析结果证实,30μM姜黄素(12 h)并不能诱导HepG2细胞p53下游靶基因p21 mRNA表达水平的升高,而80μM鬼臼毒素在相同条件下能增加细胞p21 mRNA表达水平近两倍。同时观察到CSN5 siRNA转染也不提高HepG2细胞p53转录活性。另外,p53转录活性抑制剂Pifithrin-a (PFTα、10μM、6h)也不影响姜黄素所诱导HepG2细胞p53蛋白表达水平的升高、p62蛋白表达水平的下调和自噬小体的形成。这些研究结果提示姜黄素诱导肿瘤细胞自噬和细胞p53转录活性无显著相关性。将HCT116p53-/-细胞感染野生型flag-p53r和p53突变体flag-p53r慢病毒使其稳定表达,发现30μM姜黄素(6 h)能引起HCT116p53-/-flag-p53r和HCT116p56-/-+flag-p53rR273H细胞p62蛋白表达水平的下调和自噬小体的形成,进一步明确姜黄素诱导HepG2细胞自噬依赖于p53蛋白表达水平,而非p53转录活性。再者,阐述姜黄素介导p53诱导细胞自噬在其抗肿瘤治疗中的意义。30μM姜黄素分别处理HCT116wt和HCT116p53-/-细胞6 h。与HCT116wt细胞比较,姜黄素诱导HCT116p53-/-细胞cleaved-PARP蛋白表达水平显著升高,并减少HCT116p53-/-活细胞数与细胞克隆数。但HCT116p53-/-细胞稳定表达flag-p53r或flag-p53rR273H后,姜黄素所诱导的cleaved-PARP蛋白表达水平却显著降低,而活细胞数和细胞克隆数均显著增加。为佐证这些体外细胞实验结果,本文开展了裸鼠成瘤实验,用30μM姜黄素处理HCT116wt和HCT116p53-/-细胞6 h后,分别将这些细胞注射至雌性裸鼠背部两侧,2周后,与裸鼠注射HCT116wt细胞比较,发现经姜黄素处理后裸鼠HCT116p53-/-细胞在体成瘤块较小,表明姜黄素对HCT116p53-/-细胞的杀伤效应更为明显,且姜黄素可介导p53诱导肿瘤细胞自噬促进细胞生存。HepG2和HeLa细胞经自噬相关基因5 (ATG5) siRNA转染后,发现姜黄素促进细胞cleaved-PARP蛋白表达及凋亡细胞增加。这些研究结果表明在p53阳性肿瘤细胞中,抑制自噬可促进姜黄素诱导肿瘤细胞凋亡而提高其对肿瘤细胞的杀伤效应。为进一步证明上述发现,分别用100μM临床药物自噬抑制剂氯喹预处理HCT116wt和HCT116p53-/-细胞2 h,继之30μM姜黄素处理6 h。在HCT116wt细胞上,发现姜黄素和氯喹联用所诱导细胞cleaved-PARP蛋白表达水平高于单用姜黄素,但活细胞数少于单用姜黄素。而在HCT116p53-/-细胞上,与单用姜黄素比较,姜黄素和氯喹联用诱导细胞cleaved-PARP蛋白表达水平及活细胞数并未显著变化。同时进行了裸鼠成瘤后治疗实验,在雌性裸鼠背部两侧分别注射5×106个HCT116wt和HCT116P53-/-细胞,一周后出现可见的瘤体,再随机分成三组,每隔一天分别注射100μML 0.01%二甲亚砜(DMSO)、100μL 100 μM姜黄素、及100μL 100μM姜黄素和100μM氯喹联合使用。三周后发现,注射姜黄素裸鼠HCT116wt细胞瘤体比HCT116p53-/-细胞瘤体大；与注射姜黄素比较,联用姜黄素和氯喹裸鼠HCT116wt瘤体较小；而联合注射姜黄素和氯喹的动物HCT116p53-/-瘤体与单用姜黄素无显著性差异。这些结果表明,与p53阴性肿瘤细胞比较,姜黄素对p53阳性肿瘤细胞杀伤效果并不明显,而姜黄素和自噬抑制剂联用则更有效抑制p53阳性肿瘤细胞生长。为分析姜黄素对裸鼠瘤体内细胞自噬的影响,本文提取瘤体蛋白并进行了检测。注射姜黄素能使裸鼠HCT116wt瘤体细胞p62下调、LC3-Ⅰ型向Ⅱ型转变,而对HCT116p53-/-细胞瘤体则不能产生该效应。同时,与注射姜黄素比较,姜黄素和氯喹联用裸鼠HCT116wt瘤体细胞cleaved-PARP表达更高,提示姜黄素和自噬抑制剂联用更有效促进p53阳性肿瘤细胞凋亡。姜黄素和氯喹联用裸鼠HCT116p53-/-瘤体细胞凋亡却与单用姜黄素无显著性差异。这些研究结果进一步确证姜黄素介导p53诱导细胞自噬在肿瘤细胞凋亡中起重要作用。为探究姜黄素诱导CSN5下调稳定p53蛋白促进细胞自噬途径是否也存在于正常细胞,本文用姜黄素处理正常纤维细胞BJ,发现这些细胞存在CSN5蛋白表达水平的下调、p53蛋白表达水平的升高、p62蛋白表达的下调、LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ转变以及自噬小体增加。CSN5 siRNA转染同样也诱导BJ细胞自噬小体的形成。BJ细胞经p53 siRNA转染后,可显著抑制姜黄素、CSN5siRNA转染所诱导细胞p62蛋白表达水平的下调和自噬小体的形成。与上述肿瘤细胞效应不同的是,BJ细胞经ATG5 siRNA或p53 siRNA转染后,30μM姜黄素(6 h)却不能引起正常细胞cleaved-PARP蛋白表达的变化。上述研究结果表明在人源性肿瘤细胞和正常细胞中均存在姜黄素诱导CSN5下调稳定p53蛋白促进细胞自噬途径。综上所述,本文发现了姜黄素特异性诱导人源性细胞CSN5下调稳定p53蛋白,从而促进细胞自噬途径,该独立于p53转录因子活性的全新CSN5调控p53模式参与了细胞自噬过程。同时明确这条途径所诱导的细胞自噬是肿瘤细胞拮抗姜黄素治疗效应的一个重要生存机制。由此,p53表达与否可作为预测肿瘤细胞对姜黄素是否敏感的生物标志。姜黄素对p53阴性肿瘤细胞有更好的杀伤效应；与自噬抑制剂联用则有利于姜黄素对p53阳性肿瘤的杀伤效应。抑制自噬并不能使姜黄素对正常细胞有杀伤效应。本文研究为临床姜黄素有效治疗肿瘤及增加药物抗肿瘤敏感性提供实验基础,具有重要科学价值和临床指导意义。