论文部分内容阅读
目的探讨血管生成素样蛋白4(Angiopoietin-like protein 4,ANGPTL-4)在糖尿病性视网膜病变(Diabetic retinopathy,DR)发病中的作用及其机制。方法(1)收集临床病例资料,分为4组:对照组(特发性黄斑裂孔(Idiopathic macular hole,IMH)组),糖尿病无视网膜病变(Nondiabetic retinopathy,NDR)组,非增殖性糖尿病性视网膜病变(Non-proliferative diabetic retinopathy,NPDR)组和增殖性糖尿病性视网膜病变(Proliferative diabetic retinopathy,PDR)组。四组患者均采集血清标本,IMH组和PDR组采集玻璃体标本。酶联免疫吸附实验(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)测定各组ANGPTL-4和血管内皮细胞生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)蛋白表达水平。(2)原代培养人视网膜微血管内皮细胞(Human retinal microvascular endothelial cells,HRMECs),具体分组如下:为正常浓度葡萄糖(Normal glucose,NG;5 m M)组、NG联合重组β-半乳糖苷酶慢病毒(Ad Lac Z)组、NG联合重组缺氧诱导因子1α(Hypoxia inducible factor 1 alpha,HIF-1α)慢病毒(Ad HIF-1α)组、NG联合重组人ANGPTL-4蛋白(Recombinant human angiopoietin-like protein 4,rh ANGPTL-4)组、NG联合ANGPTL-4小干扰RNA(Small interfering RNA for ANGPTL-4,si ANGPTL-4)组、NG联合重组人VEGF蛋白(Recombinant human vascular endothelial growth factor protein,rh VEGF)组、NG联合VEGF小干扰RNA(Small interfering RNA for VEGF,si VEGF)组、NG联合HIF-1α特异性抑制剂阿霉素(Doxorubicin,DOX)组、高浓度葡萄糖(High glucose,HG;30 m M)组、HG联合DOX组、HG联合rh ANGPTL-4组、HG联合si ANGPTL-4组、HG联合rh VEGF组及HG联合si VEGF组。(3)构建雄性Sprague-Dawley大鼠体内实验模型,随机分为对照组即正常血糖组(Con)、Con联合si ANGPTL-4组、糖尿病大鼠(链脲霉素腹腔注射,60 mg/kg)组(DM)、DM联合si HIF-1α组、DM联合rm ANGPTL-4组、DM联合si ANGPTL-4组和DM联合DOX组(5mg/kg/day)。(4)异硫氰酸荧光素标记的葡聚糖检测各组细胞的渗透性。(5)Western blot及Real-time PCR分别检测各组细胞和大鼠视网膜中ANGPTL-4、HIF-1α、VEGF、白细胞介素1β(Interleukin 1 beta,IL-1β)、IL-6、细胞间粘附因子(Intercellular adherent molecule 1,ICAM-1)、BAX和p53的蛋白和m RNA表达;ELISA测定各组细胞上清中ANGPTL-4和VEGF蛋白表达。(6)免疫荧光分别检测各组细胞和视网膜中HIF-1α表达;免疫组化检测各组大鼠视网膜中ANGPTL-4表达。(7)流式细胞术及TUNEL检测细胞凋亡水平。(8)Matrigel胶检测各组细胞的侵袭、迁移、增殖和管腔形成的表达。(9)数值结果采用均值±标准差表示;Kolmogorov-Smirnov统计学方法检测数据是否属于正态分布;Graph Pad Prism 4.0软件One-way ANOVA统计学方法检测组间数据差异;Pearson相关性统计学方法检验两组数据之间的相关性;多重线性回归分析统计学方法检测混杂因素。P<0.05被认为差异具有统计学意义。结果(1)同对照组相比,PDR患者玻璃体和血清中ANGPTL-4和VEGF的浓度表达水平均显著升高(P<0.01);Pearson检验发现,玻璃体中ANGPTL-4与VEGF的相关系数R=0.76(P<0.01),血清中ANGPTL-4与VEGF的相关系数R=0.60(P<0.01),玻璃体中ANGPTL-4与血清中ANGPTL-4的相关系数R=0.67(P<0.01)。(2)TUNEL检测发现,过表达ANGPTL-4显著降低HRMECs细胞的凋亡水平(P<0.01),基因沉默ANGPTL-4提示相反的结果(P<0.01)。(3)过表达ANGPTL-4显著促进HRMECs的细胞侵袭、迁移、增殖和管腔形成(P<0.01),基因沉默ANGPTL-4提示相反的结果(P<0.01)。(4)过表达ANGPTL-4显著升高HRMECs细胞渗透性,基因沉默ANGPTL-4显著抑制高糖诱导的HRMECs细胞渗透性增加(P<0.01)。ANGPTL-4在HIF-1α的调控下参与DR的渗透性;添加了si HIF-1α或药物抑制剂DOX后,均可显著降低HIF-1α的表达,进而下调ANGPTL-4的表达。(5)过表达ANGPTL-4显著降低高糖状态下视网膜中凋亡因子BAX和p53的蛋白和m RNA表达,同时上调VEGF的表达水平(P<0.05);基因沉默ANGPTL-4提示相反的结果(P<0.05)。(6)高糖状态下,基因沉默ANGPTL-4可显著降低DM大鼠视网膜中炎症因子IL-1β、IL-6和ICAM-1的蛋白和m RNA表达(P<0.05)。结论(1)ANGPTL-4和VEGF在PDR患者的玻璃体和血清中高表达,且二者具有显著相关性。(2)高糖通过诱导HIF-1α的激活,进而诱导ANGPTL-4在高糖孵育的HRMECs细胞和DM大鼠视网膜中高表达;HIF-1α特异性药物抑制剂DOX和si HIF-1α均可通过阻断HIF-1α,进而抑制ANGPTL-4的高表达。(3)HIF-1α通过ANGPTL-4/VEGF通路关键性地调控高糖状态下的HRMECs渗透性;DOX通过阻断HIF-1α对高糖孵育的HRMECs细胞和DM大鼠视网膜具有保护作用。(4)ANGPTL-4参与调控高糖引起的炎症、凋亡以及新生血管等病理生理过程,ANGPTL-4激活后促进炎症因子释放,抑制凋亡因子生成,并促进新生血管生成,ANGPTL-4在DR的临床靶向治疗中有潜在的应用前景。