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腐乳作为中国传统的发酵制品,营养价值极为丰富。然而腐乳在工业化生产过程中主要存在质量不稳定和发酵周期过长等问题。纯菌接种发酵腐乳和酶法生产腐乳是解决上述问题的有效方式之一。克东腐乳是我国典型的细菌发酵型腐乳,本研究在前期工作的基础上,利用微生物技术研究了玫瑰考克氏菌(Kocuria rosea) KDF3的菌株特性；利用酶学技术研究了玫瑰考克氏菌(Kocuria rosea) KDF3蛋白酶KRP3的酶学性质；在上述研究的基础上利用玫瑰考克氏菌(Kocuria rosea) KDF3做为发酵剂制备克东腐乳,利用玫瑰考克氏菌(Kocuria rosea) KDF3的蛋白酶KRP3进行酶法制备克东腐乳,并对其发酵过程中的理化指标进行跟踪监测；最终利用发酵工程技术,优化了玫瑰考克氏菌(Kocuria rosea) KDF3的发酵培养基和发酵过程参数。为酶法和纯菌接种发酵克东腐乳奠定基础。玫瑰考克氏菌(Kocuria rosea) KDF3的菌株特性研究结果表明,该菌株为革兰氏阳性,无芽孢,并且具有较强的蛋白水解能力,最适生长温度为30℃,最适pH为8.0,对10%的NaCl和15%的乙醇均具有较强的耐受性。玫瑰考克氏菌(Kocuria rosea) KDF3蛋白酶KRP3的酶学性质研究结果表明,蛋白酶KRP3的最适反应温度和pH分别为50℃和8.0。温度在20℃～40℃之间、pH6.0～8.0范围内,蛋白酶KRP3均具有良好的稳定性。60℃保温30min即可灭活；对11%的NaCl和10%的乙醇均有很好的耐受性；而且Ca2+和Mn2+可显著增强酶的催化活性。利用玫瑰考克氏菌(Kocuria rosea) KDF3作为发酵剂制备克东腐乳的研究结果表明,就成熟度分析而言,玫瑰考克氏菌制备的腐乳在发酵90d时,水分含量、氨基态氮、总酸度均达到成熟指标；就质构变化而言,玫瑰考克氏菌制各腐乳硬度随着发酵时间的延长逐渐变小,黏着度和硬度呈负相关；30～120d,硬度由1100g减小到300g,黏着度由4.6gsec增大到52gsec;就多肽变化而言,总峰面积由发酵30d的13811.5mAU×s增大到120d的62941.8mAU×s。不同多肽峰的此消彼长反映出蛋白质逐步转变为不同种类多肽的过程；就游离氨基酸变化而言,30～120d内,氨基酸总量由968.8mg/100g腐乳增大到2070mg/100g腐乳,必需氨基酸总量由337.25mg/100g腐乳增大到988.7mg/100g腐乳,呈鲜味氨基酸谷氨酸高出其阈值最多；其次为呈甜味氨基酸赖氨酸。在这些风味氨基酸共同作用下,形成腐乳独特的风味。利用玫瑰考克氏菌(Kocuria rosea) KDF3的蛋白酶KRP3进行酶法制备克东腐乳研究结果表明,就成熟度和质构分析而言,蛋白酶KRP3虽然水解了腐乳内部大的胶粒状蛋白质聚集体,使其蛋白质胶粒明显变小且出现孔洞,但其腐乳样品与玫瑰考克氏菌KDF3制备腐乳的成熟度和质构相比仍然具有较大差距；就多肽变化而言,总峰面积由发酵60d的10428.4mAU×s增大到120d的13100mAU×s,变化不显著；不同多肽峰的此消彼长反映出蛋白质逐步转变为不同种类多肽的过程；就游离氨基酸变化而言,从60-120d内,游离氨基酸总量由161.64mg/100g腐乳增大到315.75mg/100g腐乳,必需氨基酸总量由123.07mg/100g腐乳增大到148.89mg/100g腐乳；其中呈鲜味的谷氨酸高出其阈值最多；其次为呈苦味的缬氨酸。应用响应面法优化培养基配方以及对该菌发酵条件进行优化。优化后的培养基配方为：麦芽糖添加量为14.19g/L、大豆蛋白胨：酵母浸粉=1：1添加量为71.42g/L、磷酸氢二钾添加量为5.16g/L,在此条件下该菌菌落总数可达4.60x109CFU/mL。玫瑰考克氏菌KDF3的培养结果表明该菌体最适温度为30℃,pH为8.0,振荡频率为150r/min,在此条件下该菌菌落总数可达6.24×109CFU/mL。基于上述实验结果,玫瑰考克氏菌(Kocuria rosea) KDF3可作为潜在发酵剂菌株应用于腐乳的生产；而玫瑰考克氏菌(Kocuria rosea) KDF3蛋白酶KRP3,不适合以单一酶的形式应用于腐乳的生产。