论文部分内容阅读
目的:晶状体是眼球屈光系统的重要组成部分,同时也是唯一具有调节能力的屈光介质。白内障是最常见的晶状体疾病,是全世界造成视力损害的第二大因素,致盲的首要因素。年龄相关性白内障多见于年龄>55岁的患者,它是白内障中最常见的一种。研究年龄相关性白内障的发病机制,推迟和延缓该疾病的发病年龄和进程能够有效地减少患病人数。氧化应激是导致晶状体老化和年龄相关性白内障形成的重要原因之一,在研究中经常用过氧化氢（H2O2）诱导晶状体上皮细胞中氧化应激的产生,从而在细胞层面模拟年龄相关性白内障的形成过程。自噬是细胞内溶解消化受损细胞器和大分子蛋白质的生物学过程,其有助于维持细胞内环境的稳定。自噬通常分为三种:巨自噬（macroautophagy）,微自噬（microautophagy）和分子伴侣介导的自噬（chaperone-mediated autophagy）,其中巨自噬是研究最广泛的,本文的自噬也代指巨自噬。自噬基因4A（autophagy-related gene 4A,ATG4A）是自噬基因中的一种,它是一种半胱氨酸蛋白酶,通常通过与自噬基因8（autophagy-related gene 8,ATG8）共同发挥作用。之前已经有研究表明ATG4A与多种癌症的发生发展相关,但尚无其在眼科疾病中的研究报道。本课题以ATG4A基因过表达的晶状体上皮细胞系HLE B3（human lens epithelial cells B3）为研究对象,探索该基因与自噬、增殖、凋亡、上皮-间质转化和ROS之间的关系,并初步探索该基因可能发生作用的信号通路,从而探索ATG4A基因在晶状体发生发展和白内障形成中可能起到的作用。方法:（1）利用H2O2构建晶状体上皮细胞的年龄相关性白内障模型:通过扫描透射电镜和western blot方法检测细胞自噬情况;Western blot方法检测ATG4A表达量。（2）构建ATG4A过表达模型:利用western blot实验在蛋白水平检测ATG4A过表达模型是否成功建立。（3）检测ATG4A对晶状体上皮细胞自噬的影响:通过透射电镜和western blot实验检测ATG4A对晶状体上皮细胞中自噬的影响。通过western blot检测ATG4A影响的具体通路。（4）检测ATG4A能够影响的其他表型:通过TUNEL实验和western blot实验检测ATG4A对细胞凋亡的影响;通过EdU染色实验检测ATG4A对细胞增殖的影响;通过western blot和RT-PCR检测ATG4A对细胞上皮-间质转化的影响;通过ROS检测实验检测ATG4A对细胞中ROS水平的影响。结果:（1）与control组对比,H2O2组中,beclin,LC3BⅡ/Ⅰ的蛋白表达量显著升高,P62蛋白表达量显著下降,扫描电镜结果发现实验组中自噬泡的数量和大小与对照组相比均增加,说明该模型中自噬水平升高。除此之外,H2O2组中ROS水平明显升高,ATG4A蛋白表达量也显著升高,上皮-间质转化水平没有明显变化。（2）扫描电镜实验发现与NC组相比,OE-ATG4A组中自噬泡的数量没有明显增加,但是体积明显增大。Western blot实验结果发现OE-ATG4A组中beclin和LC3BⅡ/Ⅰ的蛋白表达量显著升高,而p62的蛋白表达量显著降低,说明OE-ATG4A组中细胞自噬水平升高。（3）western blot实验结果显示OE-ATG4A组中p-AMPK/AMPK比值升高,而p-AKT/AKT比值降低,说明ATG4A有可能通过激活AMPK和抑制AKT通路影响晶状体上皮细胞的自噬。（4）与NC组相比,OE-ATG4A组中VIM的表达量在蛋白和DNA水平均升高,E-cadherin的表达量在蛋白和DNA水平均降低,说明ATG4A可以促进晶状体上皮细胞的上皮-间质转化水平。（5）与NC组相比,通过TUNEL实验发现OE-ATG4A组中细胞凋亡率明显下降;western blot实验发现OE-ATG4A组中,BAX蛋白表达量下降,BCL2蛋白表达量升高,进一步说明ATG4A能够抑制细胞的凋亡。EdU细胞增殖检测实验结果显示OE-ATG4A组中细胞增殖水平明显升高,说明ATG4A能够促进细胞增殖。（6）ROS检测实验发现与NC组相比,OE-ATG4A组中ROS水平没有明显变化。说明ATG4A无法直接影响细胞中ROS的水平。结论:本研究表明ATG4A基因可能在晶状体的发育和年龄相关性白内障的形成过程中起到重要作用。ATG4A基因的过表达可能通过激活AMPK通路和抑制AKT通路,促进晶状体上皮细胞中的细胞自噬过程。此外,过表达ATG4A基因能够促进晶状体上皮细胞的细胞增殖和上皮-间质转化,并且抑制细胞凋亡。但ATG4A基因无法直接影响晶状体上皮细胞中的ROS水平。