【摘 要】
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甘露聚糖酶作为一种重要的半纤维素酶,能把甘露聚糖水解为甘露糖和甘露寡糖;近些年来,人们慢慢对甘露聚糖酶熟知与开发,甘露聚糖酶现在在食品、饲料、制药、石油、纺织以及纸张的加工等等行业有着举足轻重的利用价值,因此该酶的应用潜力非常之大。本研究的主要目的就是挖掘一些具有应用前景广阔的新型甘露聚糖酶。甘露聚糖是存在于植物细胞壁中的半纤维素的重要成分,其生物降解主要依靠甘露聚糖酶催化来完成。本研究重组表达并
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甘露聚糖酶作为一种重要的半纤维素酶,能把甘露聚糖水解为甘露糖和甘露寡糖;近些年来,人们慢慢对甘露聚糖酶熟知与开发,甘露聚糖酶现在在食品、饲料、制药、石油、纺织以及纸张的加工等等行业有着举足轻重的利用价值,因此该酶的应用潜力非常之大。本研究的主要目的就是挖掘一些具有应用前景广阔的新型甘露聚糖酶。甘露聚糖是存在于植物细胞壁中的半纤维素的重要成分,其生物降解主要依靠甘露聚糖酶催化来完成。本研究重组表达并鉴定了一种来自交替单胞菌科Bs31的新型甘露聚糖酶,命名为ManBs31。氨基酸序列分析显示ManBs31含有多个结构域,其中属于糖苷水解酶5家族的结构域ManBs31-GH5负责催化底物水解。ManBs31-GH5结构域通过大肠杆菌表达系统成功表达并纯化。酶活实验显示,重组甘露聚糖酶ManBs31-GH5在p H 6和70°C下表现出最大催化活力。在常见的不同类型的甘露聚糖底物中,ManBs31-GH5对魔芋葡甘聚糖的水解活性最高,特异性酶活达1070.84 U/mg。ManBs31-GH5水解甘露聚糖释放出不同长度的甘露寡糖,并没有单糖的产生,因此该甘露聚糖酶适合于制备添加于食品中的功能性甘露寡糖。同时,在本研究中,ManBs31-GH5在毕赤酵母中的成功表达为该酶分子的产业化应用奠定了坚实的基础。甘露聚糖酶催化甘露聚糖中β-1,4-甘露糖苷键的断裂,具有多种功能在不同生物技术工业中的应用。在上述研究中,从海洋微生物环境中得到了一株产高温的甘露聚糖酶菌株,后续在该环境中继续挖掘不同特性的甘露聚糖酶基因;因此在本研究中,对来源于疣微菌科细菌DG1235（Man DG1235）的β-甘露聚糖酶进行了一系列实验设计,揭示了其酶的酶学性质。该甘露聚糖酶基因的氨基酸排列表明,Man DG1235属于糖苷类水解酶26家族,与那些报道过的β-甘露聚糖酶相比,具有寥寥无几的氨基酸序列同源性。Man DG1235在大肠杆菌表达系统中成功表达并纯化,Man DG1235具有冷活性酶的典型特性,包括低温下的高活性和热不稳定性,在p H 8.0和20℃的条件下Man DG1235显示最大活性,表明它是一种微碱性的β-甘露聚糖酶。Man DG1235能够水解多种甘露聚糖底物,并且对某些类型的葡聚糖具有活性。通过同源建模建立的结构模型表明Man DG1235有四个甘露糖结合亚位,它们对称地排列在活化的裂隙中,连接β2和α2的长环,如Cj Man26C中的β2和α2,在甘氨酸中产生空间边界活性位点裂区,这可能导致Man DG1235的外作用特征,特别是从底物的非还原端切割甘露聚糖。通过对重组甘露聚糖酶Man DG1235的进一步深究,对其设计了5对引物,这5个点突变分别是Man DG1235-W101A,Man DG1235-D103A,Man DG1235-D232N,Man DG1235-Y142W,Man DG1235-Y261W,目的是通过点突变来改变p H的偏好性,结果如下:Man DG1235-W101A的最适p H是7.0;Man DG1235-D103A的最适p H是9.0;Man DG1235-D232N的蛋白不可溶;Man DG1235-Y142W的蛋白不可溶;Man DG1235-Y261W没有酶活力。
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