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研究背景：在神经系统中,突触囊泡循环是神经元间信息传递的桥梁。突触囊泡通过胞吐和胞吞作用完成一次突触囊泡循环。有研究表明,癫痫患者神经元突触有明显的功能异常,这种病态突触通过突触囊泡的快速循环再生使正常情况下每秒仅能传播数次或数十次神经冲动的突触传递功能增加到每秒数十次到数百次,使痫样放电得以迅速扩布。由于突触囊泡释放神经递质是一个由多种蛋白质介导的复杂过程,并在多个环节受到精确调控,因此,越来越多的研究集中于参与该过程的蛋白质及其相互间的作用。Dynamin-1(又称发动蛋白-1),是一种G蛋白,为三磷酸鸟苷酶(GTPase)家族的一员,由四个功能结构域组成,分别为N末端GTPase域、普列克底物蛋白同源域(pleckstrin Homology domain, PH)、GTPase效应者结构域(GTPase effector domain,GED)和C末端脯氨酸和精氨酸富集域(proline-and arginine-rich domain,PRD)。与家族其它成员DynaminⅡ、Ⅲ不同,dynamin-1只在脑、神经元突触连接部位及神经内分泌细胞中特异性表达,是一种突触前膜蛋白。目前大量研究证明,dynamin-1在突触囊泡循环及囊泡在高尔基体中的运输中发挥重要作用。因此,对dynamin-1相关作用蛋白的研究,有利于探讨dynamin-1在突触囊泡循环中的作用机制,为临床治疗癫痫寻找一个有效的靶点。研究目的：利用分子克隆技术、GST Pull-down联合质谱技术,研究dynamin-1各个结构功能域的相互作用蛋白,以探讨dynamin-1在突触囊泡循环中的作用机制。研究方法：本实验先用分子克隆技术分别构建dynamin-1 4个功能域的重组原核表达质粒pGEX-4T-2-PH、pGEX-4T-2-PRD、pGEX-4T-2-GED、pGEX-4T-2-GTPase,通过大肠杆菌表达系统及谷胱甘肽琼脂糖凝脂纯化柱对4个重组质粒进行诱导表达与纯化得到4个融合蛋白GST-PH、GST-PRD、GST-GED、GST-GTPase。然后利用GST pull-down技术分别将这4个融合蛋白与分离提取的大鼠脑突触小体进行蛋白间的相互作用,并进行蛋白质谱分析鉴定。研究结果：1.构建了pGEX-4T-2-PH、pGEX-4T-2-PRD、pGEX-4T-2-GED、pGEX-4T-2-GTPase这4个表达质粒；这4个表达质粒在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中高效表达的条件为：25℃、1mol/L IPTG、诱导表达4 h,通过Glutathione Sepharose 4B亲和层析柱分别纯化得到了高纯度的融合蛋白。2.成功分离了大鼠脑神经突触小体,经pull down技术联合LC-MS质谱分析,鉴定了在大鼠神经突触小体中与dynamin-1有相互作用的蛋白共35个。结论：本实验通过GST pull down技术共获得在大鼠神经突触小体中与dynamin-1有相互作用的蛋白35个,分别属于突触囊泡相关蛋白、细胞骨架蛋白、代谢酶,均与突触囊泡循环密切相关,其与dynaim-1的关系还有待进一步研究。本研究为以后阐明dynamin-1的功能、调控机制及破解突触囊泡循环的信号途径、蛋白网络提供了基础。