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目的食道癌相关基因4 (Esophageal cancer-related gene 4, ECRG4)是从人类食管上皮细胞内分离出来的新基因,它因在食管鳞癌中的作用而首次被人们发现。其正式名称为C2ORF40,基因定位于染色体2q12.2,编码148个氨基酸残基的多肽。据有关文献报道,ECRG4在食管鳞癌、结直肠癌、前列腺癌和神经胶质瘤中均表达下调,在食管鳞癌和神经胶质瘤中起到抑制癌细胞的增殖、迁移和侵袭的功能。因此,在食管鳞癌、结直肠癌、前列腺癌和神经胶质瘤中ECRG4被看作是一个潜在的抑癌基因,但ECRG4的确切功能目前尚无定论。近年来,有研究发现在食管鳞癌、结肠癌和神经胶质瘤中都伴随着ECRG4启动子区CpG岛高甲基化的现象,推测可能是这种高甲基化现象引起了ECRG4的基因转录沉默,从而导致ECRG4表达下调。但是,ECRG4表达调控机制仍罕见报道。2011年有研究发现ECRG4在乳腺癌中表达下调且与无病生存率相关,本实验室的前期工作也发现在乳腺癌中ECRG4的表达是下调的,因此,我们决定针对ECRG4在乳腺癌中的表达与调控以及抗肿瘤功能进行进一步研究。本研究拟对ECRG4在乳腺癌组织的表达情况进行检测,探究在乳腺癌组织以及乳腺癌细胞系中中ECRG4基因启动子区CpG岛的甲基化状态,探讨ECRG4启动子区CpG岛甲基化状态与其表达之间的关系,并初步探索ECRG4在乳腺癌中的抗肿瘤功能,以期找到新的诊断和预后指标,为以后的分子靶向治疗提供理论依据。方法1.应用半定量RT-PCR和荧光定量PCR(Q-PCR)方法检测17例配对乳腺癌新鲜组织中内源性ECRG4的mRNA表达水平；2. BSP (Bisulfite sequencing PCR)法检测17例配对乳腺癌新鲜组织ECRG4启动子区的甲基化状态；3.应用BSP和荧光定量PCR(Q-PCR)检测5-Aza-CdR处理前后SK-BR-3和MCF-7细胞的甲基化状态及mRNA表达情况；4.构建ECRG4-pcDNA3.1真核表达质粒,并用ECRG4-pcDNA3.1表达质粒或对照空质粒分别转染SK-BR-3 和 MCF-7细胞,转染48小时后收集细胞总蛋白,Western Blotting检测蛋白表达水平；5.MTT法检测转染ECRG4表达质粒前后SK-BR-3和MCF-7细胞的增殖能力改变6.流式细胞仪检测转染ECRG4表达质粒24 h后SK-BR-3和MCF-7细胞凋亡的改变7.细胞划痕实验检测转染ECRG4表达质粒48 h后MCF-7细胞迁移能力的改变结果1. RT-PCR结果显示有15例(15/17,88.2%)乳腺癌组织ECRG4的hRNA表达水平低于癌旁乳腺组织(P<0.05)；2. RT-qPC R结果显示有16例(16/17,94.1%)乳腺癌组织ECRG4的mRNA表达水平低于癌旁乳腺组织(P<0.01)；3.在乳腺癌组织中ECRG4启动子区存在明显的高甲基化现象；4.5-Aza-CdR处理SK-BR-3和MCF-7细胞72 h后其ECRG4启动子区甲基化程度明显减弱,ECRG4 mRNA的表达得以恢复和上调,且具有5-Aza-CdR浓度剂量依赖性；5.过表达E CRG4抑制了乳腺癌细胞系SK-BR-3和MCF-7的增殖(P<0.05)；6.过表达ECRG4抑制了乳腺癌细胞系MCF-7的迁移(P<0.05)；7.过表达ECRG4能够促进乳腺癌细胞系SK-BR-3和MCF-7的凋亡(P<0.05)。结论1. ECRG4在乳腺癌中mRNA表达水平下调；2.在乳腺癌中ECRG4基因启动子区存在异常高甲基化,并且这种高甲基化状态与ECRG4在乳腺癌中的mRNA表达下调相关；3.过表达ECRG4能够抑制乳腺癌细胞系SK-BR-3和MCF-7的增殖,并促进其凋亡；4.过表达ECRG4能够抑制乳腺癌细胞系MCF-7的迁移。