目的:甲状腺乳头状癌（Papillary thyroid carcinoma,PTC）的诊断主要依靠超声引导下细针穿刺细胞学检查（Fine needle aspiration cytology,FNAC）联合实验室血清标志物检测、CT等影像学检查,受多方面因素的影响,该方法存在一定的局限性。寻求可用于PTC诊断,灵敏度高、特异度强的生物标志物是近年来研究的焦点问题。本研究通过高通量测序技术（High-throughput sequencing）初步分析PTC患者和健康对照者血清外泌体中微小核糖核酸（Micro RNA,miRNA）的表达图谱,筛选分离出表达差异显著的外泌体miRNA。在此基础上,应用逆转录聚合酶链反应（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,RT-q PCR）技术来验证差异表达的外泌体miRNA,旨在为寻找潜在的PTC生物诊断标志物提供可靠的实验依据,为进一步探索明确PTC的发病机制、以及外泌体miRNA用于甲状腺相关疾病的诊疗策略奠定基础。方法:收集PTC患者血清样本6例,同期健康对照者血清样本6例,通过差速超高速离心法提取血清中的外泌体囊泡,并经过透射电子显微镜技术（Transmission Electron Microscope,TEM）、蛋白免疫印迹分析方法（Western Blot,WB）、纳米粒度电位仪（Zetasizer Ultra,ZU）技术对其直径大小和蛋白标记物进行鉴定。采用高通量测序技术建立RNA测序文库,以差异表达倍数（|log2（Fold Change）|＞1）和显著水平（P＜0.05）为标准,初步筛选出两组的差异表达外泌体miRNA。进一步对差异表达外泌体miRNA进行综合分析比较,经基因本体论分析（Gene ontology,GO）、京都基因和基因组数据库分析（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG）,并结合文献检索挖掘情况,筛选出与PTC诊断关系紧密的外泌体miRNA。应用RT-q PCR技术,在另外两组血清样本（PTC组30例,对照组30例）中,对筛选出的外泌体miRNA进行初步的临床验证,评估潜在标志物在PTC诊断过程中的临床应用价值。结果:（1）两组血清外泌体提取、纯化、鉴定实验结果显示,提取的囊泡粒径在20-200nm范围所占百分比分别为77.58%、78.48%,粒径主峰分别为119.1nm和58.7nm;囊泡负染后在TEM下可观察到直径20-200nm典型双层膜结构,且囊泡均具有显著可检测的CD63和TSG101蛋白标记物。（2）RNA文库由高通量测序技术建立,通过该文库共获得795个miRNA,其中具有明显表达差异的miRNA有47个。进一步预测其潜在的靶基因,结果显示目标基因数目范围为20-1643,中位数为415。目标基因聚集于30条信号路径中,其中与恶性肿瘤病程联系紧密的信号路径包括:MAPK路径、Ras路径、PI3K-Akt路径等。GO功能注释显示,潜在的靶基因主要集聚在机体细胞的形态和遗传代谢调节、蛋白信号转导、生物合成调控等过程。基因调控网络图分析显示,多个miRNA可以通过共同基因相互连接,发挥重要的通讯连接作用。（3）结合miRNA的表达量、差异表达倍数和文献挖掘等情况,选择其中11个差异miRNA进行RT-q PCR临床验证。结果表明,相较于对照组,PTC患者血清外泌体miRNA-4669表达明显下调（P＜0.001）,miRNA-221-3p相对表达则明显上调（P＜0.05）。受试者工作特征曲线（Receiver operating characteristic,ROC）分析显示,二者诊断PTC的曲线下面积（AreaUnder Curve,AUC）分别为0.7667、0.8333,灵敏度分别为66.67%、76.67%,特异度分别为86.67%、93.33%。两者联合诊断PTC的AUC为0.8411,灵敏度为80%,特异度为90%。结论:（1）本项研究主要采用高通量测序分析技术分别对PTC患者和健康对照者的血清外泌体miRNA表达谱进行了初步的分析,并尝试通过生物信息学分析技术进一步筛选分离出两组患者血清中的表达差异的外泌体miRNA。（2）本研究通过RT-q PCR技术初步验证了血清外泌体miRNA-221-3p和miRNA-4669在PTC诊断中的应用价值,实验结果提示血清外泌体miRNA-221-3p和miRNA-4669可能是PTC诊断的理想生物标志物。综上,本研究采用现代生物技术,从血清外泌体miRNA中筛选出可用于PTC诊断的新型生物标志物miRNA-221-3p和miRNA-4669,提示以血清外泌体miRNA为切入点,有可能是解决PTC早期诊断的新思路和新途径。