【摘 要】
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涡虫是扁形动物门的代表动物,在生物的进化历程中占据着重要的地位,是研究生物发育、进化、再生与免疫的重要模式动物。14-3-3蛋白是一类高度保守的酸性蛋白,广泛存在于所有的真核生物中,并且作为一种信号分子参与许多重要的生命活动进程。本文克隆了东亚三角涡虫（Dugesia japonica）14-3-3α和14-3-3ζ基因,并进行了再生与免疫的相关功能的研究。本研究利用RT-PCR和RACE技术克隆
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涡虫是扁形动物门的代表动物,在生物的进化历程中占据着重要的地位,是研究生物发育、进化、再生与免疫的重要模式动物。14-3-3蛋白是一类高度保守的酸性蛋白,广泛存在于所有的真核生物中,并且作为一种信号分子参与许多重要的生命活动进程。本文克隆了东亚三角涡虫（Dugesia japonica）14-3-3α和14-3-3ζ基因,并进行了再生与免疫的相关功能的研究。本研究利用RT-PCR和RACE技术克隆了Dj14-3-3α和Dj14-3-3ζ基因序列。结果表明,Dj14-3-3α基因全长1305 bp,Gen Bank数据库序号为KY070276,5’-非翻译区398 bp,3’-非翻译区124 bp,最大开放阅读框编码260个氨基酸,分子量约为29.69 k Da;Dj14-3-3ζ基因由949 bp组成,Gen Bank数据库序号为KY078796,5’-非翻译区78 bp,3’-非翻译区286 bp,编码254个氨基酸,分子量约为29.68 k Da。蛋白序列特征分析结果显示,Dj14-3-3α蛋白含有两个14-3-3蛋白家族的特征序列。利用MAGE 6.0构建进化树分析发现,东亚三角涡虫的14-3-3α和14-3-3ζ分别位于各家族进化树的基部,符合进化的顺序,可能是14-3-3α和14-3-3ζ的原始类型。利用整体原位杂交技术分析Dj14-3-3α和Dj14-3-3ζ基因的表达谱,结果显示,在成体或再生过程中,Dj14-3-3α和ζ基因的表达位置一致,均表达于涡虫的咽部;切片结果显示,Dj14-3-3α和ζ基因主要表达于涡虫咽的内、外表皮上。由于咽是涡虫的免疫器官,由此推断,东亚三角涡虫Dj14-3-3α和ζ基因可能参与涡虫免疫功能的行使。为了进一步探讨Dj14-3-3α和ζ基因在涡虫中的功能,利用RNAi技术干扰涡虫的Dj14-3-3α和ζ基因。实时定量PCR结果显示,干扰Dj14-3-3α的涡虫中Dj14-3-3ζ基因表达量明显上升;干扰Dj14-3-3ζ的涡虫中Dj14-3-3α基因表达量明显上升。由此推断,Dj14-3-3α和ζ基因在功能上可能存在着互补关系。分别用LPS、PGN、β-Glu和Poly（I:C）诱导涡虫,实时定量PCR结果显示,Dj14-3-3α和ζ基因的表达量均有明显升高。由此推断,Dj14-3-3α和ζ基因参与涡虫的早期免疫。再生过程中的实时定量PCR结果显示,Dj14-3-3α和ζ基因的表达量并无明显变化规律,推测其可能不参与涡虫咽的再生。分别构建了p ET32a-Dj14-3-3α、p GEx-Dj14-3-3α、p ET32a-Dj14-3-3ζ和p GEx-Dj14-3-3ζ原核表达载体,并表达、纯化了6his-Dj14-3-3α融合蛋白。Western blot结果表明,融合蛋白大小与目的蛋白预期大小一致;另外免疫家兔,制备了抗兔-6his-Dj14-3-3α抗体。Dj14-3-3α和ζ融合蛋白的成功表达,为在蛋白水平上更加深入的研究Dj14-3-3α和ζ的性质及其在涡虫再生和免疫过程中的功能做了铺垫。
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