RNA甲基化是最普遍的一种RNA修饰,在转录调控中起到基础性作用。N6-甲基腺嘌呤（m⁶A）是真核mRNA上含量最丰富的修饰碱基,发挥重要的生物学功能,并与很多肿瘤（如神经胶质瘤,乳腺癌等）的发生发展密不可分。FTO和ALKBH5是目前为止仅被发现的两种mRNA m⁶A去甲基化酶,可以氧化去甲基化mRNA上的m⁶A。研究m⁶A去甲基化酶的小分子抑制剂可以帮助我们更好的理解FTO和ALKBH5在体内调控的生理过程和致病机制。本论文中DNA甲基甲基转移酶（DNMT3B）抑制剂Nanaomycin A与AlkB家族蛋白通用抑制剂大黄酸（Rhein）有结构相似性,并有很好的抗肿瘤活性。故此,通过酶学实验证明了其在体外可以有效抑制FTO和ALKBH5的活性,同样地,m¹A去甲基化酶ALKBH3和ALKBH2也不例外。NMR实验表明其与FTO之间存在相互作用。胞内热迁移实验也发现Nanaomycin A在胞内减弱FTO和ALKBH5的热稳定性,表明Nanaomycin A在细胞内可以直接靶向FTO和ALKBH5。表型实验发现Nanaomycin A可以有效抑制神经胶质瘤（U251和U87）的细胞增殖。斑点印记杂交实验发现其可以增加U87胞内的m⁶A水平。为研究其作用机制,选取具有α-酮戊二酸（2OG）和Fe²⁺依赖性的5hmC羟基化酶TET1和组蛋白甲基化相关酶作进一步研究,发现Nanaomycin A可以增加在体外有效的抑制TET1的活性,但也增加了U251细胞内5hmC的水平,可能还作用于5hmC相关信号通路,这可能也与其较强的抗肿瘤活性有关。同样地,发现Nanaomycin A也能够抑制具有α-酮戊二酸（2OG）和Fe²⁺依赖性的组蛋白去甲基化酶（JARID1C、JMJD3和NSD1）。因此本论文证明了Nanaomycin A是一2OG和Fe²⁺依赖的RNA,DNA和去甲基化酶的泛抑制剂。为更好的理解RNA去甲基化酶ALKBH5在肿瘤中的作用机制,需要发展对ALKBH5的特异性小分子抑制剂。有研究意外发现在复合物晶体结构中ALKBH5的Cys200处和化合物IOX3形成共价修饰,故本论文基于对共价抑制剂的设计理念,选取一些和Cys可以形成共价键的化合物,如马来酰亚胺类（Maleimide）,α,β-不饱和酮类（α,β-unsaturated ketone）,硫醚类（Thioether）等等。通过体外酶学实验筛选到一些可以特异性抑制ALKBH5的马来酰亚胺类化合物（MM2、MM3、MM5、MM6、MM27、MM28和MM34）,从IC₅₀上来看化合物MM2的抑制活性相对较好且其化学结构具有代表性。因此,以大黄酸为阴性对照,通过小分子洗脱实验发现大黄酸组ALKBH5去甲基化活性恢复,而MM2处理后ALKBH5的活性仍未回复;并表现出时间依赖性,表明MM2可能与ALKBH5蛋白形成了共价结合。随后将ALKBH5的5处Cys分别突变成Ser,其中突变体C200S、C267S和C230S的活性减弱相对较大。并以突变体C200S为代表,用MM系列化合物处理后,其活性依然会被抑制。进行LC-MS实验发现MM2处理后的ALKBH5分子量增加了MM2分子量的4、5倍,证明两者确实以共价键的形式结合。但可能是由于MM2结构简单导致其对半胱氨酸的识别无特异性,结构有待进一步优化。但实现了ALKBH5特异性共价抑制剂的初步确证。总之,本论文提出了共价抑制剂的研究方向,为ALKBH5的特异性抑制剂的发现奠定了十分重要的基础;Nanaomycin A在神经胶质瘤细胞内的功能的发现,为表观遗传靶标的研究也起到了一定的补充作用。