目的:骨质疏松症（OP）合并膝骨关节炎（KOA）在临床上常见于中老年女性,临床治疗缺乏标准方法,源于对其病理机制的认识尚未统一、明确,我们认为:OP与KOA虽为不同骨病,而肾虚血瘀为共同病机,实为异病同证,可以异病同治。因此,本研究通过构建去卵巢大鼠骨质疏松合并疲劳损伤膝骨关节炎模型,模拟临床中老年女性骨质疏松合并膝骨关节炎的症状,观察其病理发生机制,成模后给予中药制剂强骨宝灌胃进行干预,研究强骨宝对OP合并KOA的作用及机制,探讨OP与KOA“异病同证、异病同治”的科学依据。方法:1.去卵巢大鼠骨质疏松合并膝骨关节炎模型的构建选择6月龄雌性SD大鼠,手术摘除卵巢造成激素型骨质疏松症,术后正常喂养7天后,应用大鼠跑台设备进行跑步疲劳训练,设定均度15m/min的适应性训练2天。随后改变均速30m/min,间隔5min,2次/d、上坡坡度为16°连续训练35d,造成膝关节劳损性关节炎,构建OP和KOA合并模型。制备病理组织切片,观察膝关节滑膜、关节软骨、软骨下骨的形态学变化;分析并进行软骨Mankin评分;检测尿液CTX-Ⅱ含量和血清雌二醇水平;检测分析第三腰椎及股骨颈骨平均骨密度;测试股骨三点弯曲、强度、刚度、应力应变等生物力学数据,结合MRI片,鉴定OP合并KOA水平。2.强骨宝干预OP合并KOA大鼠的疗效分析SD大鼠OP合并KOA模型建立后,给予强骨宝灌胃干预。给药剂量为3.5g/kg,分早晚2次灌服,并在给药后1、3个月测试大鼠血清雌二醇水平;骨密度、强度、刚度、应力应变等生物力学变化;膝关节病理组织形态学与组织显微结构变化等。分析强骨宝干预OP合并KOA大鼠的疗效,探讨OP和KOA异病同治的可行性。3.强骨宝干预OP合并KOA模型大鼠的分子机制研究强骨宝干预后,定期（干预后1、3个月）采集关节液和软骨组织,ELISA法测定膝关节炎性因子、膝关节软骨Wnt5a、β-catenin、OPG、RANKL等蛋白质的表达水平,分析强骨宝对膝关节软骨Wnt5a、β-catenin、OPG、RANKLm RNA的影响,探讨强骨宝基于异病同治干预OP合并KOA的分子机制。结果:1成功建立大鼠OP合并KOA模型检测分析发现,单纯卵巢摘除组（OVX）和合并跑步训练组（OVX+RUN）,在跑步训练4w和6w后,与空白对照组相比,关节液TNF-α、IL-1,尿液的CTX-Ⅱ含量均显著变化。其中OVX和OVX+RUN的E₂均比空白对照组显著降低,分别为（P<0.05）、（P<0.01）,说明摘除卵巢会显著降低E₂含量,跑步训练会使E₂含量回升。跑步训练6w的以上各因子含量分别为:OVX+RUN组:TNF-α（32.18±8.23）、IL-1（37.45±9.22）、CTX-Ⅱ（251.71±46.27）;OVX组:TNF-α（23.85±8.85）、IL-1（24.26±10.85）、CTX-Ⅱ（171.55±53.10）;BLANK组:TNF-α（11.55±4.29）、IL-1（10.43±2.79）、CTX-Ⅱ（41.55±12.03）均显著高于空白对照组的含量。跑步训练4w的以上各因子含量为:OVX+RUN组:TNF-α（28.36±4.34）、IL-1（27.91±3.8）、CTX-Ⅱ（220.85±49.42）;OVX组:TNF-α（19.98±4.84）、IL-1（17.16±4.58）、CTX-Ⅱ（143.15±38.85）;BLANK组:TNF-α（11.37±3.81）、IL-1（9.93±2.42）、CTX-Ⅱ（57.72±14.50）。均显著高于空白对照组的含量。同时跑步训练6w的各因子值又显著高于4w的。表明卵巢摘除合并跑步训练能够显著造成大鼠膝关节炎,炎症程度随跑步训练时间延长而加重。软骨Mankin评分发现,跑步训练4周后,实验组与Blank组存在极显著差异（P<0.01）。各组Mankin分别为:OVX+RUN组（6.14±0.73）、OVX组（4.94±0.49）、与BLANK组（1.14±0.41）;实验组与Blank组存在极显著差异（P<0.01）,OVX组与OVX+RUN组之间也存在显著差异。跑步训练6周后,实验组与BLANK组比较均有极显著差异（P<0.01）,各组Mankin分别为:OVX+RUN组（7.91±1.05）、OVX组（5.54±0.71）、与BLANK组（1.00±0.34）;OVX+RUN组与OVX组之间也存在极显著差异（P<0.01）;同时,与跑步训练4w的相比较,无论是OVX组还是OVX+RUN组,跑步训练6周后,其Mankin评分都显著提高了。再次表明卵巢摘除合并跑步训练能够显著造成大鼠膝关节炎,且炎症程度随跑步训练时间延长而加重。骨密度测试发现,跑步训练4周后,L3腰椎:OVX+RUN组（0.16±0.01）、OVX组（0.15±0.01）、与BLANK组（0.19±0.01）;右股骨近端R1:OVX+RUN组（0.25±0.03）、OVX组（0.22±0.02）、与BLANK组（0.29±0.02）。实验组与空白处具有极差异显著,而OVX与OVX+RUN组之间也存在显著差异。跑步训练6周后,L3腰椎:OVX+RUN组（0.13±0.01）、OVX组（0.14±0.01）、与BLANK组（0.19±0.00）;右股骨近端R1:OVX+RUN组（0.19±0.01）、OVX组（0.21±0.01）、与BLANK组（0.30±0.02）。实验组与空白处具有极差异显著,而OVX与OVX+RUN组之间也存在显著差异。跑步训练6周后,OVX+RUN组三点弯曲实验及骨密度值相比4周时均有回升。以上实验结果表明,通过卵巢摘除结合跑步训练4-6周,成功的构建了OP合并KOA大鼠模型。2强骨宝干预对去卵巢大鼠骨质疏松合并膝骨关节炎的作用研究OP合并KOA大鼠经药物干预1、3月后,测试发现:干预1个月,强骨宝灌胃组与筋骨痛消丸灌胃组与生理盐水组相比均（P<0.05）。各组E₂含量别为:强骨宝灌胃组（49.59±8.15）、筋骨痛消丸灌胃组（48.08±16.01）、生理盐水组（33.12±7.75）;干预3个月,强骨宝灌胃组与筋骨痛消丸灌胃组,与生理盐水组相比均（P<0.01,P<0.05）。各组E₂含量别为:强骨宝灌胃组（54.73±16.38）、筋骨痛消丸灌胃组（52.97±14.34）、生理盐水组（34.57±5.92）,E₂含量显著提升。软骨Mankin评分:给药干预1个月:强骨宝组、筋骨痛消丸组与生理盐水组比较均（P<0.05）,各组评分分别为:强骨宝灌胃组（4.65±0.56）、筋骨痛消丸灌胃组（4.57±0.57）、生理盐水组（5.48±1.01）;给药干预3个月:强骨宝组、筋骨痛消丸组与生理盐水组比较均（P<0.01）,各组评分分别为:强骨宝灌胃组（4.28±0.50）、筋骨痛消丸灌胃组（4.02±0.29）、生理盐水组（5.77±0.52）,均有疗效。大鼠关节液中IL-1含量测定发现,给药1月后,强骨宝组与筋骨痛消丸组都极显著（P<0.01）高于生理盐水组,各组含量分别为:强骨宝灌胃组（19.66±6.70）、筋骨痛消丸灌胃组（16.97±6.02）、生理盐水组（32.55±7.89）;给药3个月后,强骨宝组与筋骨痛消丸组都极显著（P<0.01）高于生理盐水组,各组含量分别为:强骨宝灌胃组（17.85±4.87）、筋骨痛消丸灌胃组（15.24±7.26）、生理盐水组（30.03±3.86）。大鼠关节液中TNF-α含量测定发现,给药1月后:强骨宝组、筋骨痛消丸组与生理盐水组比较（P<0.05,P<0.01）,高于生理盐水组。各组含量分别为:强骨宝灌胃组（23.51±9.31）、筋骨痛消丸灌胃组（20.22±5.50）、生理盐水组（34.03±8.99）;给药3个月后,强骨宝组、筋骨痛消丸组与生理盐水组比较（P<0.01）,高于生理盐水组。且比给药1个月时的含量显著增高,各组含量分别为:强骨宝灌胃组（22.19±8.57）、筋骨痛消丸灌胃组（18.53±7.33）、生理盐水组（37.08±10.11）;说明了强骨宝和筋骨痛消丸均能抑制IL-1、TNF-α炎症因子的表达,疗效显著。大鼠尿液中CTX-Ⅱ含量测定发现,给药1月后,强骨宝组、筋骨痛消丸组与生理盐水组比较（P<0.05,P<0.01）,高于生理盐水组。各组含量分别为:强骨宝灌胃组（395.12±147.82）、筋骨痛消丸灌胃组（303.39±93.15）、生理盐水组（562.04±106.55）;给药3个月后,强骨宝组与筋骨痛消丸组都极显著（P<0.01）高于生理盐水组,且比给药1个月时的含量显著增高,各组含量分别为:强骨宝灌胃组（333.56±88.73）、筋骨痛消丸灌胃组（260.99±75.36）、生理盐水组（529.43±110.55）;但强骨宝组与筋骨痛消丸组（P>0.05）无统计学显著差异。骨密度测定发现,给药干预1个月DXA测定结果,L3腰椎骨密度（g/cm²）示:强骨宝组、筋骨痛消丸组与生理盐水组比较（P<0.01,P<0.05）;右侧股骨R1近端示:强骨宝组、筋骨痛消丸组与生理盐水组比较（P<0.01,P<0.05）。给药干预3个月DXA测定结果,L3腰椎骨密度（g/cm²）示:强骨宝组、筋骨痛消丸组与生理盐水组比较（P<0.01,P<0.05）;右侧股骨R1近端示:强骨宝组、筋骨痛消丸组与生理盐水组比较（P<0.01,P<0.05）。给药干预3个月DXA测定结果,L3腰椎骨密度（g/cm²）示:强骨宝组、筋骨痛消丸组与生理盐水组比较（P<0.01,P<0.05）;右侧股骨上端R1示:强骨宝组、筋骨痛消丸组与生理盐水组比较（P<0.01,P<0.05）。生物力学测定发现,L3腰椎压缩试验（Compression test）检测示,药物干预1个月:强骨宝组、筋骨痛消丸组与生理盐水组比较:最大载荷（k N）、最大应力（N/mm2）、最大应变（%）均（P<0.01,P<0.05）。药物干预3个月:强骨宝组、筋骨痛消丸组与生理盐水组比较,最大载荷（k N）（P<0.01,P<0.05）;强骨宝组、筋骨痛消丸组与生理盐水组比较,最大应力（N/mm2）（P<0.01,P<0.05）、最大应变（%）（P<0.01）;右股骨近端R1三点弯曲应力检测示,药物干预1个月:强骨宝组、筋骨痛消丸组与生理盐水组比较:最大载荷（k N）、最大应力（N/mm2）、最大应变（%）、断裂载荷（k N）均（P<0.01,P<0.05）。药物干预3个月:强骨宝组、筋骨痛消丸组与生理盐水组比较:最大载荷（k N）、最大应力（N/mm2）、最大应变（%）、断裂载荷（k N）均（P<0.01,P<0.05）,具有统计学意义。说明了,经药物治疗后强骨宝组与筋骨痛消丸组都极显著高于生理盐水组,但强骨宝组与筋骨痛消丸组之间（P>0.05）无统计学显著差异。以上研究结果表明强骨宝干预OP合并KOA疗效确切,筋骨痛消丸也取得疗效,表明视OP与KOA为异病同症,进行异病同治确实可行。3强骨宝干预对去卵巢大鼠骨质疏松合并膝骨关节炎的机制研究给药干预1、3个月后,测定各组大鼠关节软骨中OPG含量结果发现,各组大鼠软骨均检测到OPG蛋白表达,给药干预1个月,各组表达量分别为:空白组（0.62±0.14）、生理盐水组（0.33±0.07）、强骨宝药组（0.50±0.13）、筋骨痛消丸组（0.57±0.13）;给药干预3个月,各组表达量分别为:空白组（0.71±0.19）、生理盐水组（0.37±0.07）、强骨宝药组（0.58±0.21）、筋骨痛消丸组（0.66±0.19）;其中正常对照组软骨组织中表达量最高;强骨宝干预组与筋骨痛消丸干预组的大鼠软骨组织中的表达量均显著减弱,生理盐水组（OP合并KOA模型组）最低。RANKL的表达量测定发现,给药干预1月后,大鼠关节软骨中RANKL的各组表达量分别为:空白组（0.30±0.10）、生理盐水组（0.51±0.12）、强骨宝药组（0.35±0.07）、筋骨痛消丸组（0.27±0.13）;给药干预3个月,各组表达量分别为:空白组（0.30±0.15）、生理盐水组（0.58±0.20）、强骨宝药组（0.31±0.10）、筋骨痛消丸组（0.24±0.12）;其中正常对照组软骨组织中表达量最低;生理盐水组（OP合并KOA模型组）表达量最高;强骨宝干预组与筋骨痛消丸干预组在大鼠软骨组织中的蛋白表达量均比空白对照组高,但两个药物干预组之间没有显著差异。Wnt5a的表达量测定发现,给药干预1月后,大鼠关节软骨中Wnt5a的含各组表达量分别为;空白组（0.43±0.06）、生理盐水组（0.76±0.13）、强骨宝药组（0.42±0.13）、筋骨痛消丸组（0.37±0.13）;给药干预3个月,各组表达量分别为:空白组（0.31±0.14）、生理盐水组（0.61±0.20）、强骨宝药组（0.41±0.16）、筋骨痛消丸组（0.33±0.15）;其中正常对照组软骨组织中表达量最低;生理盐水组（OP合并KOA模型组）表达量最高;强骨宝干预组与筋骨痛消丸干预组在大鼠软骨组织中的蛋白表达量均比空白对照组高,但两个药物干预组之间没有显著差异。β-catetin的表达量测定发现,给药干预1月后,大鼠关节软骨中β-catetin的各组表达量分别为:空白组（0.36±0.13）、生理盐水组（0.59±0.11）、强骨宝药组（0.36±0.12）、筋骨痛消丸组（0.28±0.14）;给药干预3个月,各组表达量分别为:空白组（0.36±0.10）、生理盐水组（0.57±0.18）、强骨宝药组（0.32±0.10）、筋骨痛消丸组（0.26±0.08）;其中正常对照组软骨组织中表达量最低;生理盐水组（OP合并KOA模型组）表达量最高;强骨宝干预组与筋骨痛消丸干预组在大鼠软骨组织中的蛋白表达量均比空白对照组高,但两个药物干预组之间没有显著差异。q PCR检测OPG、RANKL、Wnt5a、β-catetin的基因转录水平发现:药物干预1月、3月,两个药物干预组与生理盐水组比较基因转录水平均存在显著差异（P<0.05）,这些基因在各组的转录水平差异趋势与这些基因对应的蛋白质表达水平差异趋势完全一致,表明强骨宝以“异病同证、异病同治”干预治疗OP与KOA的疗效,可能是通过OPG、RANKL、Wnt5a、β-catetin相关联的信号转导途径来实现的。Wnt/β-catenin与骨质疏松和骨关节炎病变有着重要联系其参与了骨代谢。Wnt5a是炎性介质,参与多种炎症反应并在关节炎软骨中存在高表达。它不仅能作用于Wnt/β-catenin通路,又能激活非经典通路。在OA软骨中Wnt的刺激可导致β-catenin的聚集而影响关节炎的代谢紊乱。Wnt5a的表达量上升β-catenin也成正相关。OPG/RANKL/RANK是调节软骨损伤的重要信号通路,也是成骨与破骨细胞之间的通路。OPG与RANKL的结合可抑制骨吸收,RANK与RANKL的结合加强骨吸收。OPG/RANKL/RANK信号是Wnt/β-catenin信号通路的下游部分,Wnt/β-catenin激活下游OPG/RANKL/RANK亦可相互影响。经强骨宝治疗OPG/RANKL比值上升,膝关节软骨得到了保护及修复。在OA合并OP中,Wnt/β-catenin信号通路的调控,对防治两病的发生、发展尤为重要。结论:1.大鼠双侧卵巢切除结合疲劳运动损伤诱发,可以成功的建立OP合并KOA大鼠模型,而且新模型稳定性高,符合临床上绝经后中老年女性的膝骨关节炎病理改变过程。2.强骨宝汤剂具有益肾壮骨、活血止痛之功效,能上调大鼠血清中E₂及降低尿液Ⅱ型胶原羧基前肽（CTX-Ⅱ）,阻止关节软骨加速病变,有效降低IL-1、TNF-α炎症细胞因子并促进膝骨关节损伤修复。引导强骨宝干预OP合并KOA疗效确切,表明视OP与KOA为异病同证,进行异病同治确实可行。3.强骨宝对OPG有上调作用,可降低Wnt5a、β-catetin、RANKLm RNA的表达,表明强骨宝以“异病同证、异病同治”干预治疗OP与KOA的疗效,可能是通过OPG、RANKL、Wnt5a、β-catetin相关联的信号转导途径来实现的。4.强骨宝可调控雌激素水平,可抑制破骨细胞和增强成骨细胞的活性。方中:补肾类药物具有类雌激素样作用,可调节雌激素水平、基因蛋白的表达。活血类药物能改善全身、局部血液循环,延缓OP合并KOA的发展,达到“异病同证、异病同治”防治绝经后骨质疏松症合并膝骨关节炎的作用。