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肝片形吸虫（Fasciola hepatica）主要寄生于牛、羊等反刍动物的肝脏和肝胆管内,引起的一种吸虫病称为肝片形吸虫病,肝片形吸虫病是一种人畜共患寄生虫病,该病在全球内广泛流行,每年因片形吸虫感染造成的经济损失超过30亿美元[1]。所以早期诊断变得尤为重要。本研究对肝片形吸虫囊蚴、童虫、幼虫和成虫四个主要发育阶段运用Label-free定量蛋白质组学进行分析,四个时期共鉴定到107501条肽段,2406个蛋白。采用Max Quant软件对蛋白质组学数据进行非标记定量计算,对定量结果进行显著性差异分析,发现囊蚴与其他三个时期虫体之间存在的差异蛋白数量显著低于其他三组之间存在的差异蛋白数,且童虫与成虫之间的差异蛋白数量最多。经过韦恩图、火山图和聚类分析图分析得到的结果与Label free算法的结果相符。对差异蛋白进行GO和KEGG分析,GO结果显示在生物学进程中参与蛋白质折叠过程的蛋白质最多;在细胞组分中,富集于细胞的蛋白质最多;在分子功能中,蛋白质主要参与蛋白结合功能。KEGG结果显示差异蛋白主要参与新陈代谢、遗传信息处理、环境信息处理、细胞过程、组织系统和其他这六个方面。经过对差异蛋白数据的筛选分析,将差异蛋白分为有明显趋势的50组,其中42、49、48、12、45、47组蛋白趋势较好,Profile42组主要为钙结合蛋白、硫氧还蛋白-谷胱甘肽还原酶、硫氧还蛋白过氧化物酶、谷胱甘肽转移酶和甘油-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）。Profile 49组主要为热休克蛋白90、热休克蛋白70、肌动蛋白。Profile 48组Ca2+不敏感的EF hand、醛脱氢酶家族蛋白。Profile 12组为Ras家族蛋白、钙调素样蛋白1、肌动蛋白、钙调素样蛋白3。Profile 45为分泌组织蛋白酶L1、脂肪酸结合蛋白III、蛋白质二硫化物异构酶、钙网蛋白家族蛋白、肌球蛋白尾。Profile 47组为肌球蛋白、原肌球调节蛋白、肌球蛋白调节轻链。我选取了Profile 42组的谷胱甘肽转移酶和Profile 45组的脂肪酸结合蛋白III,作为早期诊断抗原,其中谷胱甘肽转移酶为本实验室研制并保存。脂肪酸结合蛋白III经Uni Prot查询基因序列,成功构建原核表达载体PET-30a-FhFABⅢ,片段大小399bp,蛋白大小为16k Da,经Western bloting检测,肝片形吸虫抗体能够特异性识别重组表达蛋白,用重组Fh GST和FhFABⅢ蛋白纯化后作为诊断抗原,建立间接ELISA方法并优化其条件,检测结果显示FhFABⅢ重组抗原包被浓度每孔为9.275ng;血清稀释度为1:12800;FhFABⅢ重组抗原最佳孵育时间为4℃包被过夜;最佳封闭液选5%脱脂乳;最佳二抗孵育时间为60min;最佳底物作用时间为15 min。Fh GST重组抗原包被浓度为每孔为37.5ng;血清稀释度为1:12800;Fh GST重组抗原最佳孵育时间为37℃2h包被;最佳封闭液选10%脱脂乳,最佳二抗孵育时间为30min,最佳底物作用时间为15 min。在敏感性试验中,FhFABⅢ和Fh GST最早检出肝片形吸虫感染天数均为21d;在特异性实验中,肝片形吸虫FhFABⅢ和Fh GST重组抗原与华枝睾吸虫、日本血吸虫和捻转血矛线虫均无交叉反应;对不同生产批号的酶标板进行板间和板内的重复性实验,两种重复性实验结果显示变异系数均小于10%。临床检测样本95份,结果显示FhFABⅢ的阳性检出率为16.84%（16/95）,Fh GST的阳性检出率为12.63%（12/95）。用纯化好的FhFABⅢ和Fh GST重组蛋白免疫新西兰大白兔（1mg/kg）,每间隔两周免疫一次,当抗体效价达到105以上,便可心脏采血,采用Protrin A亲和层析法纯化多抗。采用柠檬酸三钠还原法制备了20nm大小的胶体金颗粒用来标记纯化后的兔多抗。FhFABⅢ最佳多抗标记量为5.07μg/m L,最适p H值为7.5;Fh GST最佳多抗标记量为10.15μg/m L,最适p H值为8.0。差速低温纯化金标抗体,FhFABⅢ多抗标记纯化后的胶体金颗粒作1:1稀释,Fh GST兔多抗标记纯化后的胶体金颗粒作1:4稀释,分别浸泡玻璃纤维。用FhFABⅢ和Fh GST抗原在硝酸纤维素膜上划检测线（T线）,最适划线浓度均为0.8mg/m L。对两种试纸条分别进行了敏感性、重复性、特异性实验。结果显示:两种胶体金试纸条检出最早感染肝片形吸虫的时间均为21d;FhFABⅢ检测最低稀释倍数为1:60,Fh GST检测最低稀释倍数为1:80;不同批次试纸条重复检测,结果无明显差异;两种试纸条均不与华枝睾吸虫、捻转血矛线虫和日本血吸虫发生反应,表明两种试纸条的敏感性、重复性和特异性良好。两种试纸条检测临床样本95份,Fh GST试纸条检测出11份阳性血清,阳性率为11.58%（11/95）,与ELISA方法的符合率为91.67%,FhFABⅢ试纸条检测出14份阳性血清,阳性率为14.71%（14/95）,与ELISA方法的符合率为87.5%。该结果表明,制备的基于FhFABⅢ和Fh GST蛋白多克隆抗体的胶体金免疫层析试纸条能够初步检测临床样本,可用于肝片形吸虫的诊断。